小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用，属于基因工程和谷物科学领域。本发明专利技术采用真核表达的方法，获得了具有生物活性的重组小麦过氧化氢酶，具备表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。本发明专利技术还提供一种单独应用重组小麦过氧化氢酶改善面粉加工品质的方法，该重组酶能有效增强面粉粉质特性，改善面包的比容、硬度等烘焙品质。且应用过程中不需再添加其它酶制剂，简化了生产工序，有利于降低生产成本。本发明专利技术提供的重组小麦过氧化氢酶属于小麦内源酶，所添加酶制剂在面制品蒸煮、烘焙过程会失活降解为多肽或氨基酸，因此，本发明专利技术为面制品加工业提供了一种绿色、安全的新型生物面粉改良剂，用于面制品加工行业。

【技术实现步骤摘要】
小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用
本专利技术属于基因工程和谷物科学领域，具体涉及一种毕赤酵母重组小麦过氧化氢酶及其制备方法，以及毕赤酵母重组小麦过氧化氢酶在面粉加工中的应用。
技术介绍
小麦是人类赖以生存的粮食作物之一，具有种植面积广，产量高，环境适应性强等优点。小麦粉能够形成粘弹性面团，赋予了面团独特的加工品质，进而满足不同质地、不同形状面制品的加工需要。但是由于小麦生长环境和采后储藏等的影响，天然面粉的加工品质并不能完全满足面粉加工业的要求。小麦内源组分的含量主要由品种和种植条件决定，因而育种工作者希望通过品质选育和栽培条件的改善提高小麦加工性能，通过添加外源氧化剂及酶改善面粉加工性能是食品行业科学家和食品加工企业考虑的问题。近些年来，化学改良剂的危害受到人们越来越多的关注，因此，人们将目光投向更为安全有效的酶制剂，特别是以小麦内源酶为主体的面粉改良剂，成为一个新的发展方向。过氧化氢酶是一类广泛存在于植物、动物以及微生物体内的氧化还原酶，也是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，该酶在纺织、食品、医药、环保等行业具有重要的应用前景。目前，过氧化氢酶的常规获取途径是从天然产物中分离，但是，这种方法提取工艺复杂、纯化困难、纯度低、产量低，基因异源重组已成为制备重组蛋白的重要手段。添加含有过氧化氢酶的复合酶制剂可以提高面制品的品质，2001年OrientalYeast公司发现，同时添加葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶(来源不详)和抗坏血酸可以提高面包质量，包括面包芯硬度和面包比容；2012年，Novozymes公司发现添加含有柱顶孢霉来源过氧化氢酶和磷脂酶的酶制剂可以提高烘焙制品的风味。上述工作将过氧化氢酶作为其它酶制剂的辅佐材料应用，尚未见单独添加过氧化氢酶改善面粉加工品质的相关应用。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用，特别是单独添加以小麦过氧化氢酶为主的酶制剂在改善面粉加工品质中的应用。具体的，小麦过氧化氢酶在改善面团及面包品质中的应用。仅在面粉中添加小麦过氧化氢酶即能达到增强面粉粉质特性，改善面包烘焙品质的目的。所述的小麦过氧化氢酶在面粉中的添加水平为1000～3000U(酶活单位)/g面粉。添加量为1000～3000U(酶活单位)/g面粉时，可以增加面粉的稳定时间，降低面粉的弱化度，提高面包的比容，降低面包的硬度、胶黏性和咀嚼性。所述的小麦过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术提供了编码所述小麦过氧化氢酶的DNA分子，其碱基序列如SEQIDNO：2所示。该序列来源于“烟农19”品种小麦。所述的小麦过氧化氢酶可以通过对转化有真核重组表达载体的毕赤酵母进行发酵获得。所述的真核重组表达载体为包含小麦过氧化氢酶基因的真核重组表达载体。所述的小麦过氧化氢酶的毕赤酵母重组表达方法，包括如下步骤：(1)小麦过氧化氢酶基因的克隆以小麦基因组为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到过氧化氢酶基因，纯化回收PCR产物；F2：5′-CTTCTCGAGAAAAGAGAGATGGACCCCTACAAGTAC-3′；R2：5′-GGGTCTAGAAACATGCTCGGCTTGGAGCTGAG-3′；(2)重组表达载体的构建将酵母真核表达载体与步骤(1)所得的PCR产物分别用XhoI和XbaI双酶切，连接所得双酶切产物并转化大肠杆菌，筛选得到阳性克隆菌株，抽提质粒，得到小麦过氧化氢酶重组表达载体；(3)小麦过氧化氢酶重组表达菌株的构建将步骤(2)所述的小麦过氧化氢酶重组表达载体线性化后转化至毕赤酵母中，使用步骤(1)所述的引物进行毕赤酵母基因组PCR，筛选得到阳性重组表达菌株；(4)将步骤(3)所得的阳性重组表达菌株接种至BMGY液体培养基中，25～35℃、150～250r/min条件下过夜振荡培养；3000g条件下常温离心5min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀转接至BMMY液体培养基中，转接后的菌液OD600nm为1.0～5.0；25～35℃、150～250r/min条件下继续培养48～120h，期间每隔24h向培养基添加甲醇至终浓度为0.5％～2.5％(v/v)，固液分离后获得发酵上清液；即得小麦过氧化氢酶重组表达产物。为了更好的实现本专利技术的目的，还包括：(5)将步骤(4)所得发酵上清液经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后，获得纯的重组小麦过氧化氢酶。步骤(1)中，所述的小麦为“烟农19”品种小麦。步骤(2)中，所述的酵母真核表达载体为酵母真核表达载体pPICZαA；步骤(2)中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5a。步骤(3)中，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X33。步骤(4)中，所述的BMGY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、甘油10mL/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、生物素0.4mg/L。步骤(4)中，所述的BMMY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、生物素0.4mg/L、甲醇5mL/L。步骤(5)中，所述的硫酸铵盐析分级沉淀第一次沉淀所用硫酸铵浓度为15～30％饱和度，第二次沉淀为45～60％饱和度；所述的阴离子交换层析所用层析柱优选为MonoQ柱。步骤(5)中，具体包括如下步骤：(a)将步骤(4)所得发酵上清液进行硫酸铵分级沉淀；(b)4℃条件下静置2h后，并于4℃以8000g离心10min，收集沉淀；(c)向沉淀中加入少量缓冲液A，重悬后，并于4℃以8000g离心10min，收集上清液；(d)将步骤(c)所得上清液转移至透析袋中，放入缓冲液A中，4℃条件下透析24h，中间更换两次缓冲液A；(e)将透析后的样品于0.22μm微孔滤膜过滤；(f)以缓冲液A为结合缓冲液，缓冲液B为洗脱缓冲液，进行阴离子交换层析，检测各个洗脱峰活性，并收集含有目的蛋白的样品，以过氧化氢为底物测量过氧化氢酶活；收集具有过氧化氢酶活性的洗脱峰并合并，获得纯的重组小麦过氧化氢酶。所述的缓冲液A：20mmol/LTris-HCl，pH8.0；所述的缓冲液B：20mmol/LTris-HCl、1mol/LNaCl，pH8.0。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术采用真核表达的方法，获得了具有生物活性的重组小麦过氧化氢酶，具备表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。(2)本专利技术提供了一种单独应用重组小麦过氧化氢酶改善面粉加工品质的方法，该重组酶能有效增强面粉粉质特性，改善面包的比容、硬度等烘焙品质。而且，应用过程中不需再添加其它的酶制剂，简化了生产工序，有利于降低生产成本。(3)本专利技术提供的重组小麦过氧化氢酶属于小麦内源酶，所添加酶制剂在面制品蒸煮、烘焙过程会失活降解为多肽或氨基酸，因此，本专利技术为面制品加工业提供了一种绿色、安全的新型生物面粉改良剂，用于面制品加工行业。附图说明图1是实施例1中重组毕赤酵母的基因组PCR鉴定；其中，泳道M：DL5000DNAMarker；泳道1～3：重组转化子基因组PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用。

【技术特征摘要】
1.小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：单独添加以小麦过氧化氢酶为主的酶制剂在改善面粉加工品质中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的小麦过氧化氢酶在改善面团及面包品质中的应用。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的小麦过氧化氢酶在面粉中的添加水平为1000～3000U/g面粉。5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的小麦过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的小麦过氧化氢酶通过对转化有真核重组表达载体的毕赤酵母进行发酵获得；所述的真核重组表达载体为包含小麦过氧化氢酶基因的真核重组表达载体。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的小麦过氧化氢酶的毕赤酵母重组表达方法，包括如下步骤：(1)小麦过氧化氢酶基因的克隆以小麦基因组为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到过氧化氢酶基因，纯化回收PCR产物；F2：5′-CTTCTCGAGAAAAGAGAGATGGACCCCTACAAGTAC-3′；R2：5′-GGGTCTAGAAACATGCTCGGCTTGGAGCTGAG-3′；(2)重组表达载体的构建将酵母真核表达载体与步骤(1)所得的PCR产物分别用XhoI和XbaI双酶切，连接所得双酶切产物并转化大肠杆菌，筛选得到阳性克隆菌株，抽提质粒，得到小麦过氧化氢酶重组表达载体；(3)小麦过氧化氢酶重组表达菌株的构建将步骤(2)所述的小麦过氧化氢酶重组表达载体线性化后转化至毕赤酵母中，使用步骤(1)所述的引物进行毕赤酵母基因组PCR，筛选得到阳性重组表达菌株；(4)将步...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡松青，张亚萍，侯轶，刘光毅，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44