靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂‑聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用，该疫苗佐剂在疏水性内核包载TLR7激动剂，在磷脂层包载TLR4激动剂，通过磷脂层中的阳离子磷脂吸附抗原，同时甘露糖配体的连接使其具有特异性靶向抗原提呈细胞树突状细胞的能力，从而增强对DC细胞的摄取和促成熟效果；通过杂化纳米粒保护抗原并提高DC细胞对抗原的摄取，通过TLR激动剂显著增强抗原刺激后的免疫应答并显著改善抗原交叉呈递，产生强有力的T细胞杀伤效应，诱导细胞因子分泌，产生长效记忆性T细胞反应，对肿瘤有较好的预防能力。

【技术实现步骤摘要】
靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用
本专利技术涉及疫苗佐剂
，具体涉及一种靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用。
技术介绍
免疫治疗是继手术治疗、治疗和放射治疗后的又一种新型疗法。免疫治疗的作用方式有三种：1)设计单克隆抗体以增强免疫反应进而杀伤癌细胞；2)使用免疫检查点抑制剂来帮助免疫系统识别和攻击肿瘤细胞，如PDL-1、CTAL-4等；3)合成疫苗引发免疫反应来治疗和预防肿瘤。与直接用药物杀死肿瘤细胞的化学疗法不同，免疫疗法是通过激活或重建病人免疫系统并改变肿瘤微环境，使机体对肿瘤细胞重新产生识别和杀伤能力的一种治疗方法。这种治疗方法对机体正常细胞不产生损坏作用，却能抑制肿瘤的复发和转移，并且由于记忆功能的存在而具有长期免疫的效果，因此受到了广泛关注。疫苗是通过模仿机体被侵染的过程来激活免疫细胞应答的。疫苗被注射到机体后，固有免疫细胞表面上的模式识别受体(patternrecognitionreceptors,PRRs)与疫苗的病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)在注射部位结合，从而上调趋化因子和细胞因子等一系列免疫反应。注射部位的APC数目随之增加，随后通过对抗原的结合、摄取、处理等过程将抗原信息传递给T细胞。B细胞受到辅助性T细胞的活化后分泌抗体。最终，部分T、B细胞分化为记忆细胞为下次侵染做准备。一些成功的疫苗如黄热病疫苗(YF-17D)的研究表明，经由多种Toll样受体(Tolllikereceptors,TLRs)有效地激活DCs并增加促炎因子的分泌可以达到免疫系统的有效应答。TLRs是先天性免疫的主要传感器，可以激活一系列的免疫细胞。根据TLRs位置将其细分为两种类型：细胞膜相关受体(TLRs1,2,4,5和6)，主要识别细菌细胞壁成分和内体相关受体(TLRs3,4,7,8和9)，它们对细菌或病毒核酸特别敏感。已有研究表明使用TLR激动剂作为佐剂能显著增强抗原刺激后的免疫应答并显著改善抗原交叉呈递。最近，对疫苗递送的进一步研究表明了通过组合多个TLRs触发不同信号传导途径以激活协同免疫应答的重要性。单磷酰磷脂A(MonophosphoryllipidA,MPLA)(位于细胞膜上和内体上的TLR4激动剂)能够诱导强烈的Th1-极化免疫应答，同时能够显著降低LPS的毒性100-10,000倍。作为第一个被批准作为佐剂使用的TLR激动剂，MPLA已成功用于治疗宫颈癌肝炎和疟疾(RTS,)等商业疫苗。咪喹莫特(imiquimod,IMQ)是TLR7的激动剂，是一种很有前景的DCs激活剂，已被FDA批准为免疫调节剂。IMQ的局部给药在几种皮肤病的治疗中已经显示出了有效性。(IMQ5％乳膏)已被批准用于治疗浅表性基底细胞癌，光化性角化病和HPV介导的外生殖器和肛周疣。目前，核酸疫苗、蛋白疫苗、亚单位疫苗等疫苗种类的免疫原性较弱，使得疫苗的应用受到了限制同时也应运而生了佐剂的生成和发展。然而，现在批准的佐剂比如铝佐剂等只能有效激活体液免疫而无法活化细胞免疫应答，使得佐剂难以应用于癌症、乙肝、HIV等疾病。同时佐剂的安全性、与抗原的耐受性、大规模生产和制备以及商业价值等也使得疫苗佐剂很少在商业中使用。然而，游离的TLR激动剂在体内容易快速降解和清除，因此妨碍其作为疫苗佐剂的临床表现。同时，游离状态的蛋白质或肽抗原经常被迅速清除且免疫原性较差，因此只能产生短暂和较弱的免疫应答。树突状细胞(DCs)是最重要、最有效的APCs，它是摄取和处理抗原，启动免疫反应，调节适应性体液和细胞免疫的关键细胞。自从发现DCs作为免疫启动子以来，针对DCs的抗原纳米粒递送疫苗的研究一直蓬勃发展。在纳米粒设计上，APCs高度表达的甘露糖受体(Mannosereceptor,MR)赋予了其DCs特异靶向性。免疫过程中，APCs，尤其是DCs，捕获抗原后迁移至次级淋巴器官(如脾和淋巴结)中，通过主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibilitycomplex,MHC)I类和II类呈递抗原从而激活T、B淋巴细胞以及记忆细胞分化。聚合物纳米粒(Nanoparticles,NPs)具有良好的灵活性、多样性，高抗原包封率，可进行抗原提呈细胞(Antigenpresentingcell,APCs)靶向修饰，抗原与佐剂共传达以实现最佳免疫应答目的等优点。因此，它是一种非常有前景的疫苗载体。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的在于提供一种靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用。本专利技术提供一种靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，包括步骤：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL、阳离子磷脂DOTAP、TLR7激动剂、TLR4激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，用氮气吹干残余溶剂后干燥；在干燥后的产物中加入溶剂进行水化，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声形成稳定乳液，将稳定乳液过滤，收集滤液，得到负载TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液(IMQ-MPLAnanoparticles,IMNPs)；将负载TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和抗原溶液混合后孵育，得到靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂MAN-IMQ-MPLA-OVA-NPs(MAN-OVA-IMNPs)。还包括将DSPE-PEG-NH2溶于有机溶剂的步骤；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与DSPE-PEG-NH2的质量比为20mg：(0.2-1)mg；将负载TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和抗原溶液混合前，还包括步骤：在三乙胺的催化下，将负载TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和甘露糖水溶液混合后搅拌预设时间；优选地，甘露糖水溶液的质量分数为0.25％；优选地，搅拌的时间为2-4h。两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg：(0.5-2)mg；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与TLR7激动剂的质量比为20mg：(50-200)μg；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与TLR4激动剂的质量比为20mg：(5-20)μg；优选地，TLR7激动剂为咪喹莫特(IMQ)和/或咪唑喹啉(R848)，TLR4激动剂为MPLA。有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；干燥为真空干燥，干燥的时间为12-24h。溶剂为水或PBS溶液，水优选为双蒸水；溶剂的体积和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量的比值为(2-10)mL：20mg；水化的温度为65℃，水化的时间为2-12h，超声的时间为5-35min，过滤采用的是0.45μm滤膜。抗原溶液中的抗原为模型抗原卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)，也可以是蛋白质和多肽抗原等，包括乙肝表面抗原(HBsAg)、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂‑聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：将两亲性三嵌段共聚物PCL‑b‑PEG‑b‑PCL、阳离子磷脂DOTAP、TLR7激动剂、TLR4激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，用氮气吹干残余溶剂后干燥；在干燥后的产物中加入溶剂进行水化，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声形成稳定乳液，将所述稳定乳液过滤，收集滤液，得到负载TLR激动剂的阳离子磷脂‑聚合物杂化纳米粒溶液；将所述负载TLR激动剂的阳离子磷脂‑聚合物杂化纳米粒溶液和抗原溶液混合后孵育，得到所述靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂‑聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂。

【技术特征摘要】
1.一种靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL、阳离子磷脂DOTAP、TLR7激动剂、TLR4激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，用氮气吹干残余溶剂后干燥；在干燥后的产物中加入溶剂进行水化，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声形成稳定乳液，将所述稳定乳液过滤，收集滤液，得到负载TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液；将所述负载TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和抗原溶液混合后孵育，得到所述靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂。2.根据权利要求1所述的靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：还包括将DSPE-PEG-NH2溶于有机溶剂的步骤；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与所述DSPE-PEG-NH2的质量比为20mg：(0.2-1)mg；将负载TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和抗原溶液混合前，还包括步骤：在三乙胺的催化下，将所述负载TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和甘露糖水溶液混合后搅拌预设时间；优选地，所述甘露糖水溶液的质量分数为0.25％；优选地，所述搅拌的时间为2-4h。3.根据权利要求1所述的靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与所述阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg：(0.5-2)mg；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与所述TLR7激动剂的质量比为20mg：(50-200)μg；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与所述TLR4激动剂的质量比为20mg：(5-20)μg；优选地，所述TLR7激动剂为IMQ和/或R848，所述TLR4激动剂为MPLA。4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱敦皖，张琳华，务圣洁，秦玉，黄晨露，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12