一种用于HER2检测的dsDNA-AgNCs荧光探针及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于HER2检测的dsDNA‑AgNCs荧光探针及其构建方法和应用，将DNA1和DNA2进行杂交形成dsDNA，所述dsDNA与银盐及还原剂通过原位还原反应，得到AgNCs探针；其中，DNA1为HER2适配体DNA片段，DNA2包含与DNA1互补的DNA片段、合成AgNCs的模板DNA片段以及富含G碱基的DNA片段，且DNA2的两端为互补的DNA片段，该荧光探针在检测HER2过程中具有信号强、特异性高、高灵敏度等优点，且其合成方法步骤简单、低成本、条件温和，有利于推广生产和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于HER2检测的dsDNA-AgNCs荧光探针及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种用于生物标志物HER2检测的荧光探针，特别涉及一种利用杂交DNA链合成的dsDNA-AgNCs荧光探针以及利用鸟嘌呤(guanine,G)碱基序列靠近AgNCs增强AgNCs的荧光信号的原理来实现对HER2特异性荧光检测的方法，属于生物传感

技术介绍
人表皮生长因子受体2(HER2，又称Neu或ErbB2)是一种促进乳腺癌细胞生长的蛋白质。HER2成为最常见的恶性肿瘤标志物(D.J.Slamon,B.Leyland-Jones,S.Shak,H.Fuchs,V.Paton,V.N.Engl.J.Med.2001,344,783-792.)。目前已确定的检测HER2的方法有:显色原位杂交试验(CISH)(S.Kiyose,H.Igarashi,K.Nagura,T.Kamo,K.Kawane,H.Mori,T.Ozawa,M.Maeda,K.Konno,H.Hoshino,H.Konno,H.Ogura,K.Shinmura,N.Hattori,H.Sugimura,Pathol.Int.2012,62,728-734.)、荧光原位杂交(FISH)(S.Shah,B.Chen,PathologResInt.2011,903202-903217.)、免疫组织化学(IHC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)(C.B.Moelans,R.A.D.Weger,E.V.D.Wall,P.J.V.Diest,Crit.Rev.Oncol.Hematol.2011,80,380-392)、电化学(a)M.Shamsipur,M.Emami,L.Farzin,R.Saber,Biosens.Bioelectron.2018,103,54-61；b)C.Shen,K.Zeng,J.Luo,X.Li,M.Yang,A.Rasooly,Anal.Chem.2017,89,10264-10269.)等。然而，FISH和IHC需要有侵入性的活检组织标本、专业的和专用的仪器，ELISA技术非常可靠，但通常只对ng/mL范围敏感。电化学方法具有简单、快速、选择性高、灵敏度高等优点。然而，电化学方法一直以来都面临着稳定性和重复性问题，而且价格昂贵。这限制了这些方法的广泛应用。因此，建立一种简便、特异、灵敏、准确的HER2检测方法具有重要意义。近年来，AgNCs作为一种新型纳米材料，由于它比普通有机染料和量子点具有很大的优越性，包括高的光稳定性、亚纳米尺寸、稳定性、低毒性、强荧光发射性和良好的生物相容性等优点，而受到广泛关注。而且一些报道表明，AgNCs通过靠近富含G的DNA序列，其荧光强度显著增强(J.Li,X.Zhong,H.Zhang,X.C.Le,J.J.Zhu,Anal.Chem.2012，84,5170-5174.)。这一机制在许多生物分析方法中得到了广泛应用(a)X.Liu,F.Wang,R.Aizen,O.Yehezkeli,I.Willner,J.Am.Chem.Soc.2013，135,11832-11839；b)L.Zhang,J.Zhu,S.Guo,T.Li,J.Li,E.Wang,J.Am.Chem.Soc.2013,135,2403-2406.)。
技术实现思路
针对现有技术中检测HER2的方法存在的缺陷，本专利技术的第一个目的是在于提供一种用于HER2特异性荧光检测的dsDNA-AgNCs荧光探针，该荧光探针在检测HER2过程中具有信号强、特异性高、高灵敏度等优点。本专利技术的第二个目的是在于提供一种步骤简单、低成本、条件温和的构建dsDNA-AgNCs荧光探针的方法。本专利技术的第三个目的是在于提供所述dsDNA-AgNCs荧光探针在检测HER2中的应用，表现出信号强、特异性高、高灵敏度等特点。本专利技术提供了一种用于HER2检测的dsDNA-AgNCs荧光探针的构建方法，该方法是将DNA1和DNA2进行杂交形成dsDNA，所述dsDNA与银盐及还原剂通过原位还原反应，得到AgNCs探针；所述DNA1为HER2适配体DNA片段；所述DNA2包含与DNA1互补的DNA片段、合成AgNCs的模板DNA片段以及富含G碱基的DNA片段，且DNA2的两端为互补的DNA片段。本专利技术的技术方案关键在于设计了两条特殊的DNA链，DNA1为短链，是HER2的适配体，而DNA2为长链，其包含与DNA1互补的DNA片段、合成AgNCs的模板DNA片段以及富含G碱基的DNA片段，且DNA2的两端为互补的DNA片段。先将DNA2与DNA1杂交，再利用AgNCs模板原位合成银纳米簇。生成的杂交双链部分为刚性结构，将DNA2为长链支撑成链状结构，使得富含G碱基的DNA片段远离银纳米簇，表现出较弱的荧光信号，而DNA2链两端的互补DNA片段也处于自由状态，无法特异性结合。当体系中出现HER2时，DNA2结合的DNA1不断被HER2特异性结合，从而使得DNA2中间的刚性链段恢复自由单链，DNA2两端的互补DNA片段发生特异性结合，从而使得DNA2包裹纳米银簇，富含G碱基的DNA片段通过接近纳米银簇使得荧光信号增强，实现HER2的荧光检测。优选的方案，所述DNA1序列号为：5’-GGGGTGTGGCGACG-3’。优选的方案，所述DNA2序列号为：5’-ATATTACCCCAACCCCCGTCGCCACACCCCGGGGAAGGGGTAATAT-3’。本专利技术的DNA1与DNA2是自己设计序列，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。DNA1序列中5’-GGGGTGTGGCGACG-3’片段为HER2适配体片段，且利用DNA2中富含C碱基的片段来合成AgNCs，DNA2两端的5个碱基序列为互补DNA片段，而DNA2中富含G碱基的DNA为与银纳米簇产生荧光信号增强的片段。较优选的方案，dsDNA与硝酸银及硼氢化钠在溶液体系中，于室温下反应1～3h，得到dsDNA-AgNCs荧光探针。利用dsDNA中的AgNCs模板DNA片段通过原位还原合成银纳米簇。较优选的方案，dsDNA、AgNO3和NaBH4的摩尔比为1:5～7:5～7。在本专利技术的技术方案中dsDNA、AgNO3和NaBH4的摩尔比为1:6:6时，即可合成较稳定的AgNCs。实验过程所用的DNA均用磷酸缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)配制，所述DNA1与DNA2等摩尔比混合，高温解旋冷却至室温使其杂交互补，加入AgNO3溶液在室温下震荡混匀15min，随后加入新鲜配制的NaBH4，迅速震荡混匀1min，随后置于25℃恒温水浴箱中反应2h，即可检测其荧光信号，经实验证明此方法合成AgNCs仅需2h，整个DNA1-AgNCs体系2h即可达到稳定。体系达到完全的稳定，即得到检测乳腺癌标志物的荧光探针。本专利技术设计了4种DNA2[DNA2-1：8个互补(5’-ATATTATTACCCCAACCCCCGTCGCCACACCCCGGGGAAGGGGTAATAATAT-3’)；DNA2-2：5个互补(5’-ATATTACCCCAACCCCCGTCGCCACACCCCGGGGAAGGGGTAATAT-3’)；DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于HER2检测的dsDNA‑AgNCs荧光探针的构建方法，其特征在于：将DNA1和DNA2进行杂交形成dsDNA，所述dsDNA与银盐及还原剂通过原位还原反应，得到AgNCs探针；所述DNA1为HER2适配体DNA片段；所述DNA2包含与DNA1互补的DNA片段、合成AgNCs的模板DNA片段以及富含G碱基的DNA片段，且DNA2的两端为互补的DNA片段。

【技术特征摘要】
1.一种用于HER2检测的dsDNA-AgNCs荧光探针的构建方法，其特征在于：将DNA1和DNA2进行杂交形成dsDNA，所述dsDNA与银盐及还原剂通过原位还原反应，得到AgNCs探针；所述DNA1为HER2适配体DNA片段；所述DNA2包含与DNA1互补的DNA片段、合成AgNCs的模板DNA片段以及富含G碱基的DNA片段，且DNA2的两端为互补的DNA片段。2.根据权利要求1所述的一种用于HER2检测的dsDNA-AgNCs荧光探针的构建方法，其特征在于：所述DNA1序列号为：5’-GGGGTGTGGCGACG-3’；所述DNA2序列号为：DNA2：5’-ATATTACCCCAACCCCCGTCGCCACACCCCGGGGAAGGGGTAATAT-3’。3.根据权利要求1或2所述的一种用于HER2检测的dsDNA-AgNCs荧光探针的构建方法，其特征在于：dsDNA与硝酸银及硼氢化钠在溶液体系中，于室温下反应1～3h，得到dsDNA-AgNCs荧光探针。4.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓春艳，张曼曼，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43