一种血液循环肿瘤DNA提取新方法技术

本发明专利技术涉及生物科学技术领域，尤其是一种血液循环肿瘤DNA提取新方法，包括抽取血液样本、去除红细胞、裂解白细胞及消化蛋白、去除蛋白、DNA吸附提纯、DNA溶液收集，向待提取样本中加入红细胞裂解液，裂解待提取样本中的红细胞，离心分离，至红细胞完全裂解，取白色沉淀以去除红细胞，红细胞裂解液包含以下组分：3‑4mmol/L的氯化钠、10‑15g/L NH4Cl、12‑13mmol/L Tris‑HCl和0.02‑0.03mol/L的三羟甲基氨基甲烷；本发明专利技术能够快速提取血压中循环肿瘤DNA，成本低，设计巧妙，操作简单，安全环保，适合大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种血液循环肿瘤DNA提取新方法
本专利技术涉及生物科学
，尤其涉及一种血液循环肿瘤DNA提取新方法。
技术介绍
人血浆中存在游离基因组DNA，这些DNA分子是在细胞凋亡或死亡后释放到外周血中的，检测分析游离gDNA有很重要的临床意义：许多疾病状态下，比如中风、心肌梗塞、糖尿病及许多恶性肿瘤患者血浆游离gDNA会显著升高。因此血浆游离gDNA浓度可以作为疾病进展的一个临床指标，对于恶性肿瘤患者血浆中游离gDNA的检测分析更具有重要意义，因为这些gDNA分子直接来自肿瘤细胞，对其进行基因分析可以获得肿瘤恶性程度的全部信息，可以为肿瘤的诊断和治疗提供重要的依据。由于在孕妇外周血中存在胎儿的游离gDNA，因此，血浆游离gDNA分析还可以作为产前诊断的重要方法。由于血浆游离gDNA片段小，含量低，在提取过程中容易丢失，其浓度在ng/mL水平，无法用紫外分光光度法检测。需要很高的提取效率和稳定的得率才能应用于定量和相关检测。传统的苯酚/氯仿抽提法操作者需要接触苯酚、氯仿这些有害物质，影响人体健康。也有专利采用硅柱吸附法，其原理是利用DNA分子一定盐浓度下能与收集硅柱可逆吸附来提取纯化DNA。但是该方法抽提效率较低，操作繁琐，需要专用的DNA吸附柱，无法反复利用，成本高。因此，需要一种循环血DNA提取方法，其抽提效率高、操作简便、成本低廉、安全环保。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种血液循环肿瘤DNA提取新方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：设计一种血液循环肿瘤DNA提取新方法，包括抽取血液样本、去除红细胞、裂解白细胞及消化蛋白、去除蛋白、DNA吸附提纯、DNA溶液收集，向待提取样本中加入红细胞裂解液，裂解待提取样本中的红细胞，离心分离，至红细胞完全裂解，取白色沉淀以去除红细胞，红细胞裂解液包含以下组分：3-4mmol/L的氯化钠、10-15g/LNH4Cl、12-13mmol/LTris-HCl和0.02-0.03mol/L的三羟甲基氨基甲烷；向白色沉淀中加入细胞裂解液，裂解白细胞及消化蛋白，温育反应体系，细胞裂解液包含以下组份：Proclin30020-30g/L、EDTA0.6-0.8g/L、SDS20-30g/L、NaCl5-10g/L、蛋白酶K10g/L和尿素100-150g/L；去除蛋白后加入3mol/L醋酸钠溶液至醋酸钠终浓度0.3mol/L，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，4℃13000rpm离心5min；弃上清，加入2倍体积-20℃预冷的70％乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心5min，弃上清，得到DNA。优选的，抽取血液样本过程如下：1)抽取10ml静脉血加入抗凝剂；2)上下颠倒混匀，5℃运输；3)静脉血放入离心机，1500g，4℃，离心12min；4)吸取上清液至新的无菌2.0ml离心管中；5)15000g，4℃，离心12min；6)吸上清至新的无菌2.0ml离心管中。优选的，抗凝剂为枸橼酸钠、Na2EDTA·2H2O或肝素钠；枸橼酸钠终浓度为0.38％，Na2EDTA·2H2O浓度为1-1.3mg/mL。优选的，裂解白细胞及消化蛋白后加入蛋白沉淀剂以沉淀蛋白质，蛋白沉淀剂为：5-磺基水杨酸1.5份、甲醇80份和蒸馏水22份制成。优选的，得到的DNA室温干燥15min，用洗脱缓冲液溶解DNA，放在-20℃或-80℃长期保存。本专利技术提出的一种血液循环肿瘤DNA提取新方法，有益效果在于：本专利技术能够快速提取血压中循环肿瘤DNA，成本低，设计巧妙，操作简单，安全环保，适合大规模推广应用。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例1一种血液循环肿瘤DNA提取新方法，包括抽取血液样本、去除红细胞、裂解白细胞及消化蛋白、去除蛋白、DNA吸附提纯、DNA溶液收集，向待提取样本中加入红细胞裂解液，裂解待提取样本中的红细胞，离心分离，至红细胞完全裂解，取白色沉淀以去除红细胞，红细胞裂解液包含以下组分：3mmol/L的氯化钠、10g/LNH4Cl、12mmol/LTris-HCl和0.02mol/L的三羟甲基氨基甲烷；向白色沉淀中加入细胞裂解液，裂解白细胞及消化蛋白，温育反应体系，细胞裂解液包含以下组份：Proclin30020g/L、EDTA0.6g/L、SDS20g/L、NaCl5g/L、蛋白酶K10g/L和尿素100g/L；去除蛋白后加入3mol/L醋酸钠溶液至醋酸钠终浓度0.3mol/L，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，4℃13000rpm离心5min；弃上清，加入2倍体积-20℃预冷的70％乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心5min，弃上清，得到DNA。抽取血液样本过程如下：1)抽取10ml静脉血加入抗凝剂；2)上下颠倒混匀，5℃运输；3)静脉血放入离心机，1500g，4℃，离心12min；4)吸取上清液至新的无菌2.0ml离心管中；5)15000g，4℃，离心12min；6)吸上清至新的无菌2.0ml离心管中。抗凝剂为枸橼酸钠、Na2EDTA·2H2O或肝素钠；枸橼酸钠终浓度为0.38％，Na2EDTA·2H2O浓度为1mg/mL。裂解白细胞及消化蛋白后加入蛋白沉淀剂以沉淀蛋白质，蛋白沉淀剂为：5-磺基水杨酸1.5份、甲醇80份和蒸馏水22份制成。得到的DNA室温干燥15min，用洗脱缓冲液溶解DNA，放在-20℃或-80℃长期保存。实施例2一种血液循环肿瘤DNA提取新方法，包括抽取血液样本、去除红细胞、裂解白细胞及消化蛋白、去除蛋白、DNA吸附提纯、DNA溶液收集，向待提取样本中加入红细胞裂解液，裂解待提取样本中的红细胞，离心分离，至红细胞完全裂解，取白色沉淀以去除红细胞，红细胞裂解液包含以下组分：3.2mmol/L的氯化钠、12g/LNH4Cl、12.5mmol/LTris-HCl和0.025mol/L的三羟甲基氨基甲烷；向白色沉淀中加入细胞裂解液，裂解白细胞及消化蛋白，温育反应体系，细胞裂解液包含以下组份：Proclin30022g/L、EDTA0.7g/L、SDS22g/L、NaCl6g/L、蛋白酶K10g/L和尿素120g/L；去除蛋白后加入3mol/L醋酸钠溶液至醋酸钠终浓度0.3mol/L，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，4℃13000rpm离心5min；弃上清，加入2倍体积-20℃预冷的70％乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心5min，弃上清，得到DNA。抽取血液样本过程如下：1)抽取10ml静脉血加入抗凝剂；2)上下颠倒混匀，5℃运输；3)静脉血放入离心机，1500g，4℃，离心12min；4)吸取上清液至新的无菌2.0ml离心管中；5)15000g，4℃，离心12min；6)吸上清至新的无菌2.0ml离心管中。抗凝剂为枸橼酸钠、Na2EDTA·2H2O或肝素钠；枸橼酸钠终浓度为0.38％，Na2EDTA·2H2O浓度为1.2mg/mL。裂解白细胞及消化蛋白后加入蛋白沉淀剂以沉淀蛋白质，蛋白沉淀剂为：5-磺基水杨酸1.5份、甲醇80份和蒸馏水22份制成。得到的DNA室温干燥15min，用洗脱缓冲液溶解DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血液循环肿瘤DNA提取新方法，包括抽取血液样本、去除红细胞、裂解白细胞及消化蛋白、去除蛋白、DNA吸附提纯、DNA溶液收集，其特征在于：向待提取样本中加入红细胞裂解液，裂解待提取样本中的红细胞，离心分离，至红细胞完全裂解，取白色沉淀以去除红细胞，红细胞裂解液包含以下组分：3‑4mmol/L的氯化钠、10‑15g/L NH4Cl、12‑13mmol/L Tris‑HCl和0.02‑0.03mol/L的三羟甲基氨基甲烷；向白色沉淀中加入细胞裂解液，裂解白细胞及消化蛋白，温育反应体系，细胞裂解液包含以下组份：Proclin300 20‑30g/L、EDTA 0.6‑0.8g/L、SDS 20‑30g/L、NaCl 5‑10g/L、蛋白酶K 10g/L和尿素100‑150g/L；去除蛋白后加入3mol/L醋酸钠溶液至醋酸钠终浓度0.3mol/L，加入2倍体积‑20℃预冷的无水乙醇，4℃13000rpm离心5min；弃上清，加入2倍体积‑20℃预冷的70％乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心5min，弃上清，得到DNA。

【技术特征摘要】
1.一种血液循环肿瘤DNA提取新方法，包括抽取血液样本、去除红细胞、裂解白细胞及消化蛋白、去除蛋白、DNA吸附提纯、DNA溶液收集，其特征在于：向待提取样本中加入红细胞裂解液，裂解待提取样本中的红细胞，离心分离，至红细胞完全裂解，取白色沉淀以去除红细胞，红细胞裂解液包含以下组分：3-4mmol/L的氯化钠、10-15g/LNH4Cl、12-13mmol/LTris-HCl和0.02-0.03mol/L的三羟甲基氨基甲烷；向白色沉淀中加入细胞裂解液，裂解白细胞及消化蛋白，温育反应体系，细胞裂解液包含以下组份：Proclin30020-30g/L、EDTA0.6-0.8g/L、SDS20-30g/L、NaCl5-10g/L、蛋白酶K10g/L和尿素100-150g/L；去除蛋白后加入3mol/L醋酸钠溶液至醋酸钠终浓度0.3mol/L，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，4℃13000rpm离心5min；弃上清，加入2倍体积-20℃预冷的70％乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心5min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：严勇攀，王丽丽，刘程捷，
申请(专利权)人：武汉拜施普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42