一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇生物转化制备雄烯二酮的方法技术

本发明专利技术公开了一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮(AD)的方法。将分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B‑3683菌种进行种子液培养，再将种子液接种到发酵培养基中培养以制备静息细胞，所得静息细胞在含葡萄糖的Tris‑HCl缓冲液中活化培养7h，然后投入底物植物甾醇和0.1vol.％的疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体，进行离子液体/缓冲液两相生物转化反应，制备AD。本发明专利技术所用的脂肪酸季鏻盐离子液体对底物植物甾醇的溶解度高达483～616g L

【技术实现步骤摘要】
一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇生物转化制备雄烯二酮的方法
本专利技术涉及一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮的方法。
技术介绍
雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)是重要的甾体药物中间体，可用于合成上百种甾体激素类药物。以自然界中丰富的植物甾醇为底物，通过生物转化法制备AD具有广阔的应用前景。然而，分枝杆菌降解植物甾醇侧链得到AD需经过11种功能酶系协同催化的16步反应历程，迄今为止只能在全细胞中完成。存在着两个主要问题：(1)甾醇底物的低水溶性；(2)疏水性产物AD在胞内对细胞活性的抑制甚至毒性，以及析出后对底物颗粒和细胞的包结。通常，基于溶剂工程策略构建非水/水两相生物转化体系，能够促进底物溶解和实现产物的原位萃取，提高过程转化效率。随着人们对绿色过程开发的要求越来越迫切，一种新型的绿色溶剂——离子液体以其独特的理化性质逐渐进入人们的视野。离子液体(ionicliquid,IL)是由阳离子和阴离子构成的在临界温度(一般为100℃)下呈液态的有机盐。目前常用的离子液体主要是由9类阳离子(烷基咪唑类、烷基吡啶类、季铵、季鏻、吡咯烷、哌啶、吗啉、胍类等)和28类阴离子(卤素类、六氟磷酸型、四氟硼酸型、硝酸型、磺酸型、羧酸型、亚胺型等)构成，主要用于有机合成和催化、萃取分离、电化学、功能材料等领域，将生物相容性差的离子液体直接用作生物催化反应介质会带来催化效率低、资源浪费、生态毒性等问题。因此，针对生物催化反应过程筛选和合成特定结构的离子液体是提高过程效率、实现绿色催化的途径之一。离子液体/水两相体系用于全细胞生物催化过程的历史可以追溯到2000年(BiotechnologyandBioengineering.2000,69:227-233)。但是，离子液体在甾体药物生物转化中的应用还较少。2011年Wu等(BioresourceTechnology.2011,102:9368-9373)在[BMIM][PF6]/水两相体系中进行黑根霉催化16α,17-黄体酮的11α羟化反应，转化率提高到90％以上。随后，Mao等(BiotechnologyLetters.2012,34:2113-2117；JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology.2013,88:287-292)也报道了在含离子液体体系中甾体药物羟化和脱氢反应。近期，Yuan等(JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology.2016,91:2631-2637；ACSSustainableChemistry&Engineering.2017,5:10702-10709)选用13种常用商业化离子液体，系统评价了含离子液体体系中分枝杆菌降解植物甾醇侧链的反应，有效提高了转化效率。但是，商业化离子液体对甾醇溶解度依然不够高，而且对细胞的生物相容性也不理想。本专利技术结合甾醇的疏水性和氢键酸性及全细胞作为催化剂这两大特点，考虑以生物相容性好、氢键碱性强的生物分子脂肪酸为阴离子供体，生物相容性和溶解性能均较好的季鏻盐为阳离子供体合成离子液体，构建两相体系，进一步提高植物甾醇全细胞生物转化过程效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备AD的方法。提供了一种离子液体/水两相体系中分枝杆菌静息细胞降解植物甾醇侧链制备AD的方法，包括如下步骤：(a)以分枝杆菌Mycobacteriumsp.NRRLB-3683(菌种编号ATCC29472)为菌种，进行种子液培养；其中菌种可购买自https://www.atcc.org/Search_Results.aspx？dsNav＝Ntk:PrimarySearch％7c29472％7c3％7c,Ny:True,Ro:0,N:1000552&searchTerms＝29472&redir＝1。该菌种在CN1507489A中也有公开报导。(b)将步骤(a)所得种子液接种到发酵培养基中培养，制备静息细胞，冷冻保存备用；(c)将步骤(b)所得静息细胞在含葡萄糖的Tris-HCl缓冲液中活化培养2～12h，然后投入1～30gL-1底物植物甾醇和0.1～1vol.％的疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体，进行离子液体/缓冲液两相生物转化反应，制备AD。优选地，所述种子培养基中添加玻璃珠以分散细胞，种子液培养温度为28℃，摇床转速为180rpm，培养时间为24～48h。优选地，所述发酵培养在底部加工有2个大小约15×8×2mm挡板的500mL锥形瓶中进行，发酵培养基中添加1～2gL-1用tween80水溶液预分散的植物甾醇作为诱导剂，接种量为8～12vol.％，发酵培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，培养时间为48～60h。发酵培养完成后，离心收集菌体，用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤，即得所述静息细胞。优选地，所述静息细胞浓度为50gL-1，葡萄糖浓度为2gL-1，Tris-HCl缓冲液为pH7.5，0.1M，所述植物甾醇为白色粉末，主要成分为β-谷甾醇(45％)、豆甾醇(26.2％)、菜油甾醇(23.5％)和菜籽甾醇(3.2％)，纯度≥95％。优选地，所述疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体的阳离子为三己基十四烷基鏻(P6,6,6,14+)，阴离子为含8～18个碳的脂肪酸根。合成步骤为：将三己基十四烷基溴化鏻通过强碱性阴离子交换层析柱得到三己基十四烷基氢氧化鏻，再与等摩尔量的脂肪酸混合，在圆底烧瓶中45℃下搅拌反应至完全中和，然后通过加热搅拌并伴随空气吹扫直至恒重，以除去溶剂，得到离子液体。优选地，所述生物转化反应在底部加工有2个挡板的锥形瓶中进行，反应温度为30℃，摇床转速为200rpm。本专利技术的优势在于：用于构建两相生物转化体系的疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体对底物植物甾醇的溶解度达483～616gL-1，并随着离子液体阴离子烷基侧链的延长而增大，相比于普通商业化离子液体提高了100倍以上，能有效解决底物水溶性差的问题，结合离子液体对产物的原位萃取，提高过程转化效率，且离子液体用料极少，有利于节约生产成本。附图说明图1为合成的离子液体三己基十四烷基鏻辛酸盐([P6,6,6,14][C7H15COO])的1HNMR(500MHz,DMSO-d6)谱图；图2为合成的离子液体三己基十四烷基鏻辛酸盐([P6,6,6,14][C7H15COO])的13CNMR(500MHz,DMSO-d6)谱图；图3为离子液体/水两相体系中植物甾醇生物转化过程机理示意图(a：单水相体系，b：离子液体/水两相体系，MB:分枝杆菌细胞，S：底物，P：产物，l：液态，s：固态，Eq：平衡状态)。具体实施方式以下的具体实施例对本专利技术展开了详细的描述，但本专利技术并不限制于以下实施例。实施例1：三己基十四烷基鏻辛酸盐离子液体([P6,6,6,14][C7H15COO])/缓冲液两相体系中植物甾醇生物转化制备AD，具体如下：步骤一：制备离子液体[P6,6,6,14][C7H15COO]。具体地，将[P6,6,6,14][Br]的乙醇溶液以流速1mLmin-1通过填充有DowexMonosph本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮(AD)的方法，其特征在于包括以下步骤：(a)以分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B‑3683(菌种编号ATCC 29472)为菌种，进行种子液培养；(b)将步骤(a)所得种子液接种到发酵培养基中培养，制备静息细胞，冷冻保存备用；(c)将步骤(b)所得静息细胞在含葡萄糖的Tris‑HCl缓冲液中活化培养2～12h，然后投入1～30g L‑1底物植物甾醇和0.1～1vol.％的疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体，进行离子液体/缓冲液两相生物转化反应，制备AD。

【技术特征摘要】
1.一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮(AD)的方法，其特征在于包括以下步骤：(a)以分枝杆菌Mycobacteriumsp.NRRLB-3683(菌种编号ATCC29472)为菌种，进行种子液培养；(b)将步骤(a)所得种子液接种到发酵培养基中培养，制备静息细胞，冷冻保存备用；(c)将步骤(b)所得静息细胞在含葡萄糖的Tris-HCl缓冲液中活化培养2～12h，然后投入1～30gL-1底物植物甾醇和0.1～1vol.％的疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体，进行离子液体/缓冲液两相生物转化反应，制备AD。2.如权利要求1所述两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备AD的方法，其特征在于步骤(a)中种子培养基中添加玻璃珠以分散细胞。3.如权利要求1所述两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备AD的方法，其特征在于步骤(a)中种子液培养温度为28℃，摇床转速为180rpm，培养时间为24～48h。4.如权利要求1所述两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备AD的方法，其特征在于步骤(b)中发酵培养基中添加1～2gL-1用tween80水溶液预分散的植物甾醇作为诱导剂。5.如权利要求1所述两相体系中植物甾...

【专利技术属性】
技术研发人员：关怡新，袁俊杰，肖霞，肖超，姚善泾，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33