阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除的方法及应用技术

本发明专利技术公开一种阴沟肠杆菌blaNDM‑1基因敲除的方法及应用，涉及基因工程技术领域。利用Red同源重组技术成功地将阴沟肠杆菌blaNDM‑1基因敲除，通过PCR和测序验证blaNDM‑1基因被成功敲除仅保留了1个FRT位点，进一步通过基因表达量验证阴沟肠杆菌的blaNDM‑1基因表达量为对照菌株的1.2倍，说明此技术可用于阴沟肠杆菌的基因敲除与整合，同时验证了blaNDM‑1基因敲除前后菌株生长趋势与生长速度无明显差异，对体外竞争力和耐药性有一定影响；为阴沟肠杆菌中其他基因功能的研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除的方法及应用
本专利技术涉及基因工程
，具体的涉及一种阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除的方法及应用。
技术介绍
抗菌药物的耐药史可追溯到抗菌药物的发现及使用，近几年由于抗菌药物的广泛使用导致耐药致病菌也迅速增加；碳青霉烯类抗生素因具有抗菌谱广、抗菌作用强、耐酶且稳定等优点，临床长期广泛应用于治疗产超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum-β-lactamases,ESBLs)及高产AmpC型β-内酰胺酶的革兰阴性菌引起的严重感染，被誉为治疗革兰阴性菌感染的最后一道防线(thelast-resortantibiotic)；但随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae，CRE)开始出现并逐年不断增加；blaNDM-1基因大多位于大小不一的可接合性质粒上，某些质粒具有较强的转移能力和广泛的宿主适应范围，能在肠杆菌科细菌、假单胞菌属、气单胞菌属及霍乱弧菌属等多种属细菌中存在，并能通过接合方式在菌种内或菌种间传播。正是这些因素导致NDM-1酶阳性菌株具有流行性广、耐药性强和易传播性等特点，已成为严重影响全球的公共医疗安全问题之一。金属β-内酰胺酶(MBLs)是一类活性位点结合有金属离子且必须依赖金属离子(主要是Zn2+)的存在而发挥催化活性的β-内酰胺酶，该酶的水解活性强但能被EDTA、2-巯基丙酸等络合剂抑制，是肠杆菌科细菌对碳青酶烯类抗生素耐药主要原因之一，该酶主要包括IMP、VIM、GIM、SPM、SIM及新发现的NDM-1。NDM-1酶是由269个氨基酸组成的单一晶体，蛋白分子量27.5KDa，等电点为6.9，与其他的MBLs氨基酸序列相似性较低，与最相似的VIM-1/VIM-2相比，也只有32.4％的一致性。NDM-1含有两个锌离子结合位点即Zn1、Zn2，锌离子在底物识别过程中起着重要作用，所以将锌离子定义为NDM-1活性中心，此活性中心较大、开放、有柔性，具有静电剖面、与底物结合或释放时活性中心能重排等特点，导致NDM-1具有强耐药性[56-57]。作为MBLs家族的新成员，NDM-1酶无疑超过了其他几种MBLs，成为了近年来威胁最严重的MBLs。但目前国内外学者大多聚焦在NDM-1酶阳性菌株耐药机制及转播机制的研究，而对于blaNDM-1基因是否对菌株的生长能力和竞争力等其他生物学特性有影响却尚无定论。Red同源重组技术是由Datsenko和Wanner等基于λ噬菌体Red重组系统建立的新型基因敲除技术，它重组效率高、所需同源臂短、不需构建打靶质粒，省去了体外DNA酶切和连接等步骤，缩短了试验时间，提高了试验效率。但Red同源重组技术最初是用于大肠埃希菌的基因敲除和整合，目前已将其用于肺炎克雷伯菌、痢疾杆菌和沙门氏菌等细菌的基因敲除，但阴沟肠杆菌未见报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除的方法，用于敲除阴沟肠杆菌质粒上的blaNDM-1的耐药基因，从而验证blaNDM-1基因对阴沟肠杆菌的耐药性、生长能力和体位竞争力的影响。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术是通过以下技术方案实现：一种阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除的方法，包括以下步骤：步骤一、阴沟肠杆菌质粒抗性改造采用质粒小提取试剂盒对氨苄青霉素耐药的阴沟肠杆菌质粒提取，通过PCR扩增四环素抗性基因片段，并采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收四环素抗性基因片段的PCR产物，将纯化的PCR产物进行酶切连接反应得到酶切连接产物，并将其转化人大肠埃希菌DH5α感受态细胞后进行酶切鉴定重组质粒；步骤二、Red重组系统依托质粒转化入阴沟肠杆菌采用超级感受态细胞制备试剂盒制备阴沟肠杆菌感受态细胞，将步骤一得到的重组质粒转化入制备的阴沟肠杆菌感受态细胞，对细菌基因组DNA进行提取得到阳性克隆阴沟肠杆菌；步骤三、同源重组片段的制备和纯化先通过PCR扩增同源重组片段，采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收PCR产物，并进行DNA浓缩处理；步骤四、阴沟肠杆菌电击感受态细胞的制备及同源重组片段的电转化步骤五、PCR鉴定阴沟肠杆菌ΔNDM-1∷Kn重组子步骤六、卡那霉素抗性基因的去除制备阴沟肠杆菌ΔNDM-1∷Kn感受态细胞，将pCP20质粒转化入阴沟肠杆菌ΔNDM-1∷Kn感受态细胞，过夜培养，隔天对单克隆菌落进行氯霉素和卡那霉素敏感检测，对其敏感的菌落为blaNDM-1基因敲除的阴沟肠杆菌。进一步的，所述步骤一酶切连接反应为：限制性内切酶对待改造质粒和PCR产物进行酶切；采用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切DNA片段并采用T4连接酶连接酶切片段得到酶切连接产物。本专利技术的另一目的在于，提供一种敲除blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌的验证方法，包括：采用RNA试剂盒提取RNA；通过反转录系统对RNA进行反转录聚合酶链反应；之后对blaNDM-1基因进行检测。应用阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除方法制备的敲除blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌在鉴定blaNDM-1基因对菌株的耐药性和体外竞争力和生长能力的影响。本专利技术的有益效果为：本专利技术利用Red同源重组技术成功地将阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除，通过PCR和测序验证blaNDM-1基因被成功敲除仅保留了1个FRT位点，进一步通过基因表达量验证阴沟肠杆菌的blaNDM-1基因表达量为对照菌株的1.2倍，说明此技术可用于阴沟肠杆菌的基因敲除与整合，同时验证了blaNDM-1基因敲除前后菌株生长趋势与生长速度无明显差异，对体外竞争力和耐药性有一定影响；为阴沟肠杆菌中其他基因功能的研究奠定基础。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例所述pKD46-Tet的PCR和PvuⅠ酶切产物电泳图(M：MiddleDNAMarkerI；1：PvuⅠ酶切pKD46；2：PvuⅠ酶切pKD46-Tet；3：pKD46-Tet的PCR产物)；图2为本专利技术实施例所述阴沟肠杆菌T2/pKD46-tetPCR鉴定(M:DNAMaker；1、2：阳性克隆菌株)；图3为本专利技术实施例所述PCR扩增卡那霉素抗性片段(M：DL5000DNAMaker；1-6：带有blaNDM-1同源臂的PCR产物)；图4为本专利技术实施例所述重组子T2ΔNDM-1∷Kn的PCR鉴定(M：DL5000DNAMaker：1-5：重组子T2ΔNDM-1∷Kn；6：阴沟肠杆菌T2)；图5为本专利技术实施例所述PCR鉴定阴沟肠杆菌T2ΔNDM-1(M：DL2000DNAMaker；1-4：阴沟肠杆菌T2ΔNDM-1；5：重组子T2ΔNDM-1∷Kn)；图6为本专利技术实施例所述阴沟肠杆菌T2与基因敲除株的生长曲线；具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阴沟肠杆菌blaNDM‑1基因敲除的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、阴沟肠杆菌质粒抗性改造采用质粒小提取试剂盒对氨苄青霉素耐药的阴沟肠杆菌质粒提取，通过PCR扩增四环素抗性基因片段，并采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收四环素抗性基因片段的PCR产物，将纯化的PCR产物进行酶切连接反应得到酶切连接产物，并将其转化人大肠埃希菌DH5α感受态细胞后进行酶切鉴定重组质粒；步骤二、Red重组系统依托质粒转化入阴沟肠杆菌采用超级感受态细胞制备试剂盒制备阴沟肠杆菌感受态细胞，将步骤一得到的重组质粒转化入制备的阴沟肠杆菌感受态细胞，对细菌基因组DNA进行提取得到阳性克隆阴沟肠杆菌；步骤三、同源重组片段的制备和纯化先通过PCR扩增同源重组片段，采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收PCR产物，并进行DNA浓缩处理；步骤四、阴沟肠杆菌电击感受态细胞的制备及同源重组片段的电转化步骤五、PCR鉴定阴沟肠杆菌ΔNDM‑1∷Kn重组子步骤六、卡那霉素抗性基因的去除制备阴沟肠杆菌ΔNDM‑1∷Kn感受态细胞，将pCP20质粒转化入阴沟肠杆菌ΔNDM‑1∷Kn感受态细胞，过夜培养，隔天对单克隆菌落进行氯霉素和卡那霉素敏感检测，对其敏感的菌落为blaNDM‑1基因敲除的阴沟肠杆菌。...

【技术特征摘要】
1.一种阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、阴沟肠杆菌质粒抗性改造采用质粒小提取试剂盒对氨苄青霉素耐药的阴沟肠杆菌质粒提取，通过PCR扩增四环素抗性基因片段，并采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收四环素抗性基因片段的PCR产物，将纯化的PCR产物进行酶切连接反应得到酶切连接产物，并将其转化人大肠埃希菌DH5α感受态细胞后进行酶切鉴定重组质粒；步骤二、Red重组系统依托质粒转化入阴沟肠杆菌采用超级感受态细胞制备试剂盒制备阴沟肠杆菌感受态细胞，将步骤一得到的重组质粒转化入制备的阴沟肠杆菌感受态细胞，对细菌基因组DNA进行提取得到阳性克隆阴沟肠杆菌；步骤三、同源重组片段的制备和纯化先通过PCR扩增同源重组片段，采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收PCR产物，并进行DNA浓缩处理；步骤四、阴沟肠杆菌电击感受态细胞的制备及同源重组片段的电转化步骤五、PCR鉴定阴沟肠杆菌ΔNDM-1∷Kn重组子步骤六、卡那霉素抗性基因的去除制备阴沟肠杆菌ΔND...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜艳，尧静，李娅，宋宇，
申请(专利权)人：昆明医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：云南,53