普通核不育突变体的创制方法技术

本申请公开了一种普通核不育突变体的创制方法，包括以下步骤：T1.利用基因敲除技术，构建基因敲除载体；T2.利用农杆菌介导方法，将载体介导入胚性细胞中，从而获得育性基因被沉默的细胞。所述T1.利用基因敲除技术，构建基因敲除载体中，sgRNA序列设计如下：5’‑ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC‑3’5’‑AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG‑3’。本发明专利技术方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。

【技术实现步骤摘要】
普通核不育突变体的创制方法
本专利技术涉及分子生物植物不育突变体创制
，特别涉及一种普通核不育突变体的创制方法。
技术介绍
雄性不育性是与作物杂种优势利用密切相关的重要性状。水稻是利用杂种优势最为成功的作物之一，也是迄今发现雄性不育多样性最为丰富的作物之一。雄性不育系成为杂种优势利用的最有效武器，其中三系”法是我国推广杂交水稻最早，也是最普遍的一种育种和制种方法，“三系法”主要是利用了核质互作雄性不育系统，完成了“恢复系”、“保持系”和“繁殖系”的三系配套。其中的不育是由细胞质的遗传物质和细胞核的遗传物质共同决定。而光温敏雄性不育系材料为基础的“两系法”，虽然它打破了恢保关系的限制，极大的提高了配组自由度，繁殖和配组程序也极大的简化，但育性的转换收环境温度和光照的影响，制种风险较大，这也是两系杂交育种无法大面积推广的原因。自1966年袁隆平先生报道隐性核不育水稻后，相继发现了许多不育材料。这类不育材料的共同特点是不育性稳定、杂交制种安全，易于配制高产、优质、多抗组合；共同的缺点是无法实现不育系种子的批量繁殖。针对这一问题，科学家们一直在研究利用分子设计方法，解决不育系繁殖的难题，也先后提出了一些解决方案。针对解决隐性核雄性不育材料的繁殖问题，1993年6月11日，PLANTGENETICSYSTEM公司(Albertsen)提出了一项PCT专利申请，该专利提出了一种技术思想：在纯合的雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因、花粉失活(败育)基因以及用于筛选的标记基因，可以获得该雄性不育植株的保持系，保持系通过自交就可以实现不育系和保持系的繁殖。2002年，Perez-Prat等人提出，除了利用上述三套元件的思想可以实现不育系创制和繁殖以外，还可以通过在纯合的雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因和用于筛选的标记基因两套元件，由此也可以获得该雄性不育植株的保持系，并进一步繁殖不育系(Perez-Prat，2002)。这些报道提出了利用分子生物学技术手段，解决隐性核雄性不育基因及不育材料的繁殖问题，为开展分子设计杂交育种提供了新的思想。以上分子设计育种的新思想基于的是水稻细胞核上一对控制育性的基因。当此基因发生突变后，成为无功能的基因后，水稻花粉发育形成的过程受阻，从而产生无活性或不产生花粉，最终表现为不育。因此，突变体的获取是后续基因改造的基础，如何获取育性基因突变的突变体成为制约此项工作的关键点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供了一种普通核不育突变体的创制方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种普通核不育突变体的创制方法，包括以下步骤：T1.利用基因敲除技术，构建基因敲除载体；T2.利用农杆菌介导方法，将载体介导入胚性细胞中，从而获得育性基因被沉默的细胞。所述普通核不育突变体的创制方法，进一步包括：T3.基因敲除检测。所述普通核不育突变体的创制方法，进一步包括：T4.转基因植株表型鉴定。所述T1.利用基因敲除技术，构建基因敲除载体中，sgRNA序列设计如下：5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。所述T2.利用农杆菌介导方法，将载体介导入胚性细胞中，从而获得育性基因被沉默的细胞中，按照唯尚立德试剂盒(Catelog.NO.Vk005-103)中的实验步骤，完成载体的构建，并完成农杆菌的转化。所述步骤T2中，水稻转基因过程中用到的培养基包括：诱导培养基：NB；2，4-D1.8-2.0mg/mL；6-BA0.1-0.2mg/mL；琼脂粉10-15g/L：继代培养基：NB；2，4-D1.8-2.0mg/mL；CH0.2-0.3g/L；蔗糖28-30g/L；琼脂粉10-15g/L；共培养培养基：NB；AS100-200umol/L。所述步骤T2中，水稻转基因的操作步骤包括：1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织；2)侵染：将1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于2中(含有敲除载体质粒的农杆菌，即第说明书第8页中的步骤2中获得的菌株)获得的农杆菌悬浮液中侵染，之后晾干待用；3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，培养至愈伤组织表面出现菌体；4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到筛选培养基中进行抗性筛选，获得抗性愈伤组织；5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到分化培养基上培养至分化出幼苗。所述步骤T3中，基因敲除检测进一步包括：取再生苗，剪取100mg的鲜嫩的叶片，利用CTAB法提取DNA，具体步骤如下：(1)取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5mlEppendorf管中；(2)加入800μl的CTAB提取缓冲液，混匀，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min；(3)小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；(4)小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；(5)重复步骤(4)1-2次，以蛋白层不出现为止；(6)取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，离心10min；(7)弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次；(8)室温下干燥后，溶于30-50μlDEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种植物不育突变体基因敲除的检测方法，包括以下步骤：取再生苗，剪取100mg的鲜嫩的叶片，利用CTAB法提取DNA，具体步骤如下：(1)取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5mlEppendorf管中；(2)加入800μl的CTAB提取缓冲液，混匀，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min；(3)小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；(4)小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；(5)重复步骤(4)1-2次，以蛋白层不出现为止；(6)取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，离心10min；(7)弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次；(8)室温下干燥后，溶于30-50μlDEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。所述步骤T3中，基因敲除检测进一步包括：以上述提取的DNA为模板进行片段扩增，并检测阳性植株；扩增程序包括：本专利技术有益效果包括：提供了一种普通核不育突变体的创制方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。附图说明图1为本专利技术实施例所述花粉活力检测结果；其中，左图是对照植株，右图是转基因植株；图2为本专利技术实施例所述育性表现图；其中，左图为对照植株；右图是CYP78A13基因被敲除的植株。具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种普通核不育突变体的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：T1.利用基因敲除技术，构建基因敲除载体；T2.利用农杆菌介导方法，将载体介导入胚性细胞中，从而获得育性基因被沉默的细胞。

【技术特征摘要】
1.一种普通核不育突变体的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：T1.利用基因敲除技术，构建基因敲除载体；T2.利用农杆菌介导方法，将载体介导入胚性细胞中，从而获得育性基因被沉默的细胞。2.根据权利要求1所述普通核不育突变体的创制方法，其特征在于，进一步包括：T3.基因敲除检测。3.根据权利要求2所述普通核不育突变体的创制方法，其特征在于，进一步包括：T4.转基因植株表型鉴定。4.根据权利要求1所述普通核不育突变体的创制方法，其特征在于，所述T1.利用基因敲除技术，构建基因敲除载体中，sgRNA序列设计如下：5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。5.根据权利要求1所述普通核不育突变体的创制方法，其特征在于，所述T2.利用农杆菌介导方法，将载体介导入胚性细胞中，从而获得育性基因被沉默的细胞中，按照唯尚立德试剂盒中的实验步骤，完成载体的构建，并完成农杆菌的转化。6.根据权利要求1所述普通核不育突变体的创制方法，其特征在于，所述步骤T2中，水稻转基因过程中用到的培养基包括：诱导培养基：NB；2，4-D1.8-2.0mg/mL；6-BA0.1-0.2mg/mL；琼脂粉10-15g/L；继代培养基：NB；2，4-D1.8-2.0mg/mL；CH0.2-0.3g/L；蔗糖28-30g/L；琼脂粉10-15g/L；共培养培养基：NB；AS100-200umol/L。7.根据权利要求1所述普通核不育突变体的创制方法，其特征在于，所述步骤T2中，水稻转基因的操作步骤包括：1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织；2)侵染：将1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于农杆菌悬浮液中侵染，之后晾干待用；3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，培养至愈伤组织表面出现菌体；4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到筛选培养基中进行抗性筛选，获得抗性愈伤组织；5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到分化培养基上培养至分化出幼苗。8.根据权利要求2所述普通...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳音，米铁柱，张国栋，邹丹丹，李继明，丁锦燕，刘鹏飞，
申请(专利权)人：青岛袁策集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37