复合酶制剂的生产和纯化工艺制造技术

本发明专利技术属于酶制剂技术领域，公开了复合酶制剂的生产和纯化工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备里氏木霉种子液，步骤2）制备匍枝根霉种子液，步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，步骤4）制备产酶培养基，步骤5）混合发酵产酶，步骤6）分离和纯化。本发明专利技术通过对粗酶液进行分离、纯化工艺，提高了酶活力，酶活损失少。

【技术实现步骤摘要】
复合酶制剂的生产和纯化工艺
本专利技术属于酶制剂
，涉及复合酶制剂的生产和纯化工艺。
技术介绍
木聚糖酶是指可将半纤维素降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称。木聚糖酶在饲料、食品、造纸、纺织、医药及能源等领域有着广泛的应用。木聚糖酶用作饲料酶制剂，可以有效解除木聚糖的抗营养作用，促进畜禽对粗饲料的消化吸收。木聚糖酶作为新型的纸浆漂白助剂，降低漂白用氯，解决纸浆工业中的环境污染问题。在纤维素燃料乙醇的生产实践中，添加木聚糖酶可剥离木质素与纤维素之间的聚合态，易于酶解过程中的酶与底物的充分接触，利于酶解反应的发生，同时能够分解半纤维素成为酵母可利用的单糖，提高出酒率，降低纤维乙醇的成本。木聚糖酶在自然界分布广泛，可从动物、植物和微生物中获得。例如，海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母菌、瘤胃和反刍动物细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都有木聚糖酶存在。微生物来源的木聚糖酶普遍存在于自然界中，且种类繁多，应用领域广泛，因此对微生物木聚糖酶的研究报道很多。木聚糖酶的生产菌株主要由细菌、真菌和霉菌。影响产酶的因素有很多，包括菌株选择，培养条件等。日前研究和应用得最多的是细菌和真菌来源的木聚糖酶。木聚糖酶主要利用真菌和细菌等微生物进行发酵生产。木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用。微生物发酵产碱性木聚糖酶在我国起步较晚，大多处于基础研究阶段，国内自主产品稀少，产品酶活低。专利CN102776166A公开了一种木聚糖酶生产方法，利用黑曲霉菌，以乳糖为主原料，采取液体深层发酵法生产木聚糖酶，但木聚糖酶的活力水平较低。专利CN105969752A公开了一种碱蓬筛选制备耐碱性木聚糖酶的制备方法，取葡萄糖、纤维素等混合，经高温灭菌制得细菌培养基，接种短小芽孢杆菌M-26，培养得到培养液，分离制得木聚糖酶，但是存在发酵成本较高的缺点。纤维素酶是指能水解纤维素β-1,4的葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶三个主要成分组成的诱导型复合酶系。当三个主要成分的活性比例适当时，就能完成纤维素的降解。现有技术大多采用单一菌株发酵生产一种酶，两种以上的菌株混合发酵生产两种以上的酶制剂的方式比较少，因为不同的菌株之间容易产生拮抗，产酶机理不同，难以协同共生。目前，已经有报道将里氏木霉和黑曲霉共培养，可以促进纤维素酶和半纤维素酶的分泌，并且木聚糖酶也有所提高，对于其他菌株的混合产酶报道较少。但是某些领域需要两种以上酶的产品，通常的做法是将不同的酶进行混合制备获得。近年来含有两种以上酶类型的酶制剂应用越来越广泛，据报道，在生长猪的玉米豆粕麸型日粮中加入木聚糖酶和纤维素酶后，猪的粗纤维的消化率能够提高30%以上，粗蛋白消化率提高10％以上。此外，木聚糖的酶解产物低聚木糖还具有调节动物肠道微生态环境、降低动物结肠炎的发生率和减少抗生素等兽药用量的功效，可使动物的生产性能得到进一步提高。玉米秸秆属于农业废弃，大多被随意丢弃或者焚烧，但是焚烧会造成环境污染，已经被国家明令禁止，目前，很多企业在研究玉米秸秆的利用方法。由于原玉米秸秆中含有丰富的纤维素、半纤维素和木质素，因此，可以作为菌株发酵产酶的底物。申请人之前的研究是采用混合发酵方式生产木聚糖酶和纤维素酶，在此基础上，申请人继续对发酵液进行了分离和纯化，制备出酶制剂。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，在已有研究的基础上，本专利技术提供了复合酶制剂的生产和纯化工艺。本专利技术的技术方案是通过如下方式来实施的：复合酶制剂的生产和纯化工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备里氏木霉种子液，步骤2）制备匍枝根霉种子液，步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，步骤4）制备产酶培养基，步骤5）混合发酵产酶，步骤6）分离和纯化。进一步地，所述步骤1）制备里氏木霉种子液，包括如下步骤：将里氏木霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为2×108cfu/ml的里氏木霉种子液。进一步地，所述步骤2）制备匍枝根霉种子液，包括如下步骤：将匍枝根霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到种子培养基上进行种子培养，获得浓度为5×108cfu/ml的匍枝根霉种子液。优选地，所述种子培养基的组分为：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.6%，玉米浆2%，余量为水，以上为重量百分比。进一步地，所述步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，包括如下步骤：将短小芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到短小芽孢杆菌种子液。进一步地，所述步骤4）制备产酶培养基，包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，然后与豆粕按照1:1的质量比混合，再添加到3-4倍重量的水中，然后500rpm搅拌5min，再升温至60℃，保温条件下，超声处理30min，超声频率为28kHz，然后添加磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L，121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到产酶培养基。进一步地，所述步骤5）混合发酵产酶，包括如下步骤：往发酵罐中装60%体积的产酶培养基，将里氏木霉种子液按照5-10%的接种量接种到发酵罐中，控制通气比为1:1.5，搅拌转速为100rpm，培养温度为30℃，培养12h，然后接种匍枝根霉种子液和短小芽孢杆菌种子液，接种量均为5-10%，通气比1:1.8，搅拌转速200rpm，培养温度32℃，继续培养12h，然后添加玉米秸秆粉20-40g/L，继续培养48-60h，得到发酵液；整个培养过程中，通过流加氨水控制pH为7.5-8.5。优选地，所述玉米秸秆粉的制备方法包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，即得。进一步地，所述步骤6）分离和纯化，包括如下步骤：将发酵液以5000rpm的转速离心10min，收集菌体沉淀和上清液，菌体沉淀用于制备菌体蛋白出售；将硫酸铵按照1kg:5L的比例添加至上清液中，搅拌混合，并置于0℃冰水浴处理60min，然后置于8000rpm离心分离10-15min，收集下层沉淀，再添加5倍重量的纯化水，搅拌均匀，通过DEAE-Sepharose离子交换层析柱，洗脱，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到复合酶制剂。本专利技术菌株选择：实施方式中具体使用的菌株为里氏木霉ATCC66589，匍枝根霉ATCC60748，短小芽孢杆菌ATCC700814；也可以使用同一种属中功能类似的其他菌株。本专利技术技术方案通过对现有技术的改进，带来一系列的有益效果，主要包括以下几个方面：里氏木霉的产纤维素酶能力较强，可以将纤维素组分酶解产生还原糖供匍枝根霉和短小芽孢杆菌使用，而且匍枝根霉和短小芽孢杆菌能够共生，可以利用纤维素酶解产生的还原糖，产生木聚糖酶酶解木质素，而酶解产物的消耗能够解除对纤维素酶的抑制作用；本专利技术三种菌株具备协同产酶能力，木聚糖酶和纤维素酶的酶活较高，适合后续生产复合酶制剂；玉米秸秆和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.复合酶制剂的生产和纯化工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备里氏木霉种子液，步骤2）制备匍枝根霉种子液，步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，步骤4）制备产酶培养基，步骤5）混合发酵产酶，步骤6）分离和纯化。

【技术特征摘要】
1.复合酶制剂的生产和纯化工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备里氏木霉种子液，步骤2）制备匍枝根霉种子液，步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，步骤4）制备产酶培养基，步骤5）混合发酵产酶，步骤6）分离和纯化。2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤1）制备里氏木霉种子液，包括如下步骤：将里氏木霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到里氏木霉种子液。3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述步骤2）制备匍枝根霉种子液，包括如下步骤：将匍枝根霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到种子培养基上进行种子培养，获得匍枝根霉种子液。4.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述种子培养基的组分为：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.6%，玉米浆2%，余量为水，以上为重量百分比。5.根据权利要求3或4所述的工艺，其特征在于，所述步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，包括如下步骤：将短小芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到短小芽孢杆菌种子液。6.根据权利要求4或5所述的工艺，其特征在于，所述步骤4）制备产酶培养基，包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，然后与豆粕按照1:1的质量比混合，再添加到3-4倍重量的水中，然后500rpm搅拌5min，再升温至60℃，保温条件下，超声处理30min，超声...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡叶飞，金如，张宏杰，金荣培，
申请(专利权)人：杭州园泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33