一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法及应用。本发明专利技术利用CeO2包覆双金属Pd@Ag纳米粒子作为催化材料，与检测抗体孵化后作为标记物，同时利用金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球作为电极修饰材料，成功构建了夹心型免疫传感器，从而实现了对肿瘤标志物CA199、CA125的检测，具备灵敏度高，特异性强，检测限低的优势，对肿瘤的早期检测具有重要的科学意义和应用价值。

Preparation and application of a Pd@Ag@CeO2 labeled immunosensor

The invention belongs to the field of immune analysis and biosensor technology, and provides a preparation method and application of an immune sensor labeled with Pd@Ag@CeO2. The present invention uses CeO_2 coated bimetallic Pd@Ag nanoparticles as catalytic material, after incubation with detection antibodies as markers, and uses gold nanoparticles loaded with amino-functionalized microporous carbon spheres as electrode modification materials to successfully construct sandwich immunosensors, thereby realizing the detection of tumor markers CA199 and CA125. It has the advantages of high sensitivity, high specificity and low detection limit. It has important scientific significance and application value for early detection of tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法及应用
本专利技术属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感
，涉及一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Pd@Ag@CeO2为检测抗体标记物，实现了对肿瘤标志物CA199、CA125的灵敏检测。
技术介绍
随着工业化进程的加快，肿瘤的发病率呈现出不断增加的趋势。肿瘤几乎在人体各个器官、组织皆可出现,但在早期不易察觉，并且肿瘤的生长和转移的速度快，严重威胁人们健康和生命。肿瘤标志物在肿瘤的辅助诊断、疗效监测、预后判断等方面发挥了重要作用。因此，降低肿瘤死亡率的主要途径是实现早期对肿瘤标志物的灵敏检测。目前，对于肿瘤标志物的检测方法有很多，如酶联免疫法，放射免疫法，时间分辨荧光法等，但这些方法在环保防护、操作速度、定量检测等方面各有不足之处，因此，专利技术一种特异性强，灵敏度高，检测速度快，操作简便的免疫传感器十分重要。电化学免疫传感器依靠抗原与其相应抗体的特异性结合，已经广泛应用于各种肿瘤标志物的检测，一般可分为夹心型免疫传感器和无标记型免疫传感器。夹心型电化学免疫传感器结合了高灵敏的传感技术和高特异的免疫反应，具有检测快速、分析灵敏度高、特异性强、使用简便且成本低等优点，已广泛应用于环境监测、食品安全控制、生物监测、临床检验等领域。金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球具有大的比表面积和良好的生物相容性，可以显著提高捕获Ab1的固载量；良好的电子传递能力可以增强电极的导电性。Pd@Ag@CeO2能够提供良好的协同催化作用，同时CeO2作为保护层可以有效地保护贵金属，减少贵金属的团聚作用。本专利技术采用金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球作为基底材料，Pd@Ag@CeO2作为催化材料与检测抗体进行孵化作为标记物，构建了用于肿瘤标志物检测的夹心型电化学免疫传感器。
技术实现思路
本专利技术提供了一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的灵敏检测。本专利技术的目的之一是提供一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法。本专利技术的目的之二是将所制备的基于Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器应用于肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测。本专利技术的技术方案，包括以下步骤。1.一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法，步骤如下：（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；（2）取6µL、1.0~3.0mg/mL的金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）将6µL、8~12µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；（4）继续将3µL、0.5~1.5mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（5）滴加6µL、0.1pg/mL~100ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（6）将6µL、1.5~3.5mg/mL检测抗体孵化物Pd@Ag@CeO2-Ab2溶液滴至电极表面，置于4°C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干，制得一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器。2.所述金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球分散液的制备，步骤如下：（1）金纳米粒子溶液的制备在300mL的三口烧瓶中加入1~3mL、质量分数为1%的氯金酸和99mL超纯水；100°C油浴加热，溶液开始沸腾时加入1.5~3.5mL、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，回流10~30min，冷却至室温，得到酒红色的金纳米粒子溶液；（2）微孔碳球的制备在烧杯中加入40mL超纯水，16mL无水乙醇，0.2mL的质量分数为25%的氨水，搅拌10~30min；依次加入0.4~0.8g苯酚、0.50~0.70mL、质量分数为37%的甲醛溶液，转移到30°C恒温水浴中，在搅拌条件下反应24h；将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，100°C下反应24h，离心洗涤，所得固体产物在40°C真空干燥箱中干燥24h；干燥好的固体与KOH按质量比4:1混合，研磨1h，进行活化，将活化后的固体放入管式电阻炉内在氮气的保护下进行碳化；碳化后的固体用10%的盐酸浸泡1h，离心洗涤，40°C的真空干燥箱中干燥24h，制得的微孔碳球；所述碳化，具体步骤如下：管式电阻炉采用程序升温控制，以1°C/min的速度升温到350°C，保持1h；再以2°C/min升温到700°C，保持2h，后冷却至室温；（3）金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球分散液的制备在300mL的三口烧瓶中加入0.1~0.3g微孔碳球和10~30mL无水乙醇，超声震荡30min，用微量移液枪准确量取0.1~0.3mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷加入三口烧瓶中，70°C搅拌加热1.5h，得到氨基功能化微孔碳球的悬浊液,然后取10mL金纳米粒子溶液加入上述悬浊液中持续震荡30min，无水乙醇离心洗涤，在40°C的真空干燥箱中干燥24h，制得金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳粉末；取10~30mg金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳粉末，超声分散于10mL的超纯水中，制得金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球分散液，放置在4°C的冰箱中，备用。3.所述检测抗体孵化物Pd@Ag@CeO2-Ab2溶液的制备，步骤如下：（1）PdNPs的制备分别取60~80mg抗坏血酸，110~120mg聚乙烯吡咯烷酮和600~800mg溴化钾溶于8mL超纯水中，在80°C下加热10min，再将3.0~4.0mL、0.0625mol/L四氯化钯酸钠水溶液快速注入反应溶液中，反应3h后，依次用超纯水和丙酮离心洗涤3次，得到PdNPs，重新分散在10mL超纯水中，制成PdNPs分散液，备用；（2）Pd@Ag@CeO2的制备依次将1.0~2.0mL的PdNPs分散液，2.5~3.5mL、0.02mol/L的硝酸银溶液加至10mL超纯水中，搅拌10min，使其形成胶体溶液，再加入0.2~0.4mL、0.1mol/L的醋酸铈溶液，于100°C下油浴加热3h，所得产物依次用丙酮和超纯水离心洗涤三次，在40°C的真空干燥箱中干燥，制得Pd@Ag@CeO2；（3）检测抗体孵化物Pd@Ag@CeO2-Ab2溶液的制备将1~3mg的Pd@Ag@CeO2加至1mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，超声分散，再加入100μL、80~120μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900μL、50mmol/L的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12h，离心分离，将下层沉淀重新分散至1mL、50mmol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物Pd@Ag@CeO2-Ab2溶液，4°C下保存备用。4.肿瘤标志物的检测，步骤如下：（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL，含10mmol/L铁氰化钾的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；（2）用差分脉冲伏安法对分析物进行检测，初始电位为0V，终止电位为0.5V，脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为50ms，脉冲周期为50ms，记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；（2）取6 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 °C冰箱中干燥；（4）继续将3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；（5）滴加6 µL、0.1pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；（6）将6 µL、1.5 ~ 3.5 mg/mL检测抗体孵化物Pd@Ag@CeO2‑Ab2溶液滴至电极表面，置于4 °C冰箱中孵化40 min，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器。

【技术特征摘要】
1.一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；（2）取6µL、1.0~3.0mg/mL的金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）将6µL、8~12µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；（4）继续将3µL、0.5~1.5mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（5）滴加6µL、0.1pg/mL~100ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（6）将6µL、1.5~3.5mg/mL检测抗体孵化物Pd@Ag@CeO2-Ab2溶液滴至电极表面，置于4°C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干，制得一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法，所述金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球分散液的制备，步骤如下：（1）金纳米粒子溶液的制备在300mL的三口烧瓶中加入1~3mL、质量分数为1%的氯金酸和99mL超纯水；100°C油浴加热，溶液开始沸腾时加入1.5~3.5mL、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，回流10~30min，冷却至室温，得到酒红色的金纳米粒子溶液；（2）微孔碳球的制备在烧杯中加入40mL超纯水，16mL无水乙醇，0.2mL的质量分数为25%的氨水，搅拌10~30min；依次加入0.4~0.8g苯酚、0.50~0.70mL、质量分数为37%的甲醛溶液，转移到30°C恒温水浴中，在搅拌条件下反应24h；将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，100°C下反应24h，离心洗涤，所得固体产物在40°C真空干燥箱中干燥24h；干燥好的固体与KOH按质量比4:1混合，研磨1h，进行活化，将活化后的固体放入管式电阻炉内在氮气的保护下进行碳化；碳化后的固体用10%的盐酸浸泡1h，离心洗涤，40°C的真空干燥箱中干燥24h，制得的微孔碳球；所述碳化，具体步骤如下：管式电阻炉采用程序升温控制，以1°C/min的速度升温到350°C，保持1h；再以2°C/min升温到700°C，保持2h，后冷却至室温；（3）金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球分散液的制备在300mL的三口烧瓶中加入0.1~0.3g微孔碳球和10~30mL无水乙醇，超声震荡30min，用微量移液枪准确量取0.1~0.3mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷加入三口烧瓶中，70°C搅拌加热1.5h，得到氨基功能化微孔碳球的悬浊液,然后取10mL金纳米粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：李月云，张晓波，吕慧，张春燕，张栓，贾翌雷，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37