衍生化HPLC-UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛的方法技术

本发明专利技术公开了衍生化HPLC‑UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4‑硝基苯甲醛的方法，包括使用硝基苯肼类衍生化试剂对4‑硝基苯甲醛衍生化生成在紫外可见光区有较强吸收的产物，以反应液作为进样样品，利用HPLC‑UV/Vis法基于反相分配色谱法原理在紫外可见光区测定其中4‑硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4‑硝基苯甲醛的定性或定量检测。本发明专利技术基于硝基苯肼类衍生化试剂的4‑硝基苯甲醛衍生化产物由于腙键在硝基对位的生成，紫外吸收带出现明显的红移效应，从而建立了一种简单、通用的柱前衍生化HPLC‑UV/Vis测定4‑硝基苯甲醛的方法。方法学验证的结果显示本发明专利技术方法专属性良好。

【技术实现步骤摘要】
衍生化HPLC-UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛的方法
本专利技术属于药品分析检测领域，涉及一种衍生化HPLC-UV/Vis法测定4-硝基苯甲醛的方法，尤其涉及一种衍生化HPLC-UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛的方法。
技术介绍
基因毒性杂质(Genotoxicimpurities,GTIs)是一类特殊的药物杂质，由于其具有潜在的人类致癌作用而越来越受到制药行业和药品监管机构的关注[1-5]。药物中基因毒性杂质的毒理学关注阈值(Thresholdoftoxicologicalconcern,TTC)取决于药物的日服用剂量和暴露期[6-8]。人用药品注册技术要求国际协调会议(InternationalConferenceonHarmonization,ICH)M7(step2)提出分阶段TTC如下：服药持续时间少于1个月的为120μg/天，持续时间为1至12个月的为20μg/天，持续时间为1至10年的为10μg/天，持续时间超过10年的为1.5μg/天[9]。由于对检测基因毒性杂质的方法有简单和高灵敏度的要求，在ppm水平测定复杂药物样品中的这些杂质面临着相当大的挑战[10]。氯霉素(Chloroamphenicol)是一种广谱抗生素，其各种制剂是常规临床应用的重要药物。4-硝基苯甲醛是氯霉素的主要合成原料和光降解产物[11]。值得注意的是，已有文献报道了在细菌回复突变试验(Ames试验)和枯草杆菌重组修复试验(rec试验)中4-硝基苯甲醛的致突变性[12]，阳性的实验结果表明该化合物能够引起DNA损伤。该作者提出，对位硝基取代的芳香族化合物对DNA的反应活性更高且空间位阻更小，故4-硝基苯甲醛是致突变性最强的硝基芳香醛异构体。同时，根据啮齿类动物体内微核试验的结构“警报”的综述，芳香醛基和芳香硝基都是具有人类遗传毒性潜力的结构“警报”[13]。因此，我们应将药物中的4-硝基苯甲醛作为基因毒性杂质加以控制。氯霉素的最大日服用剂量约为3g[14]，而它通常是短期用药的药物，所以TTC为120μg/天[9]。药物的TTC值(120μg/天)除以最大日服用剂量(3g/天)，得出氯霉素药物中4-硝基苯甲醛的含量不应超过40ppm[6]。因此，我们需要一种灵敏且快速的方法测定氯霉素及制剂中的4-硝基苯甲醛。各国药典应用了高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)和薄层色谱法对氯霉素中的4-硝基苯甲醛进行控制[15-17]。然而，这些方法缺乏足够的特异性以避免其他相关物质的干扰，且灵敏度不足以将该杂质作为基因毒性杂质来控制。据专利技术人所知，目前没有文献报道测定药物中痕量4-硝基苯甲醛的方法。Manju等人[18]开发了一种衍生化HPLC-UV方法，结合盐辅助液-液微萃取技术提取和浓缩衍生化产物，用于测定注射剂中的苯甲醛。还有文献报道了结合HPLC-UV的顶空液滴内衍生化方法，采用了微萃取技术将分析物预浓缩了200倍[19]。尽管这两种方法灵敏度较好，但是浓缩衍生物的复杂性和对分析物挥发性的要求都是方法应用的障碍，故不适用于检测氯霉素或其制剂中残留的4-硝基苯甲醛。用于检测药物中苯甲醛的直接的气相色谱法(GC)[20]和HPLC-UV法[21]也已被报道，但均在专属性或灵敏度方面存在不足。此外，有报道采用2-硝基苯肼(2-NPH)[22]用于人血浆样品中杂环醛的定量分析，检测波长仅为330nm，同时需要采用用固相微萃取(SPE)对样品进行了浓缩富集。也有报道采用3-硝基苯肼(3-NPH)[23]用于人血浆样品中脂肪醛的定量分析，采用质谱检测器进行测定，但是并不适用于实验室常规检测。此外，关于硝基苯肼类试剂用于衍生醛类化合物的系统比较还未有报道。在各种分离分析方法中，HPLC-UV/Vis法因其简单实用而成为了大多数实验室的首选方法，但由于大多数药物及其相关物质有较强的紫外吸收，因此专属性不足是该法的主要缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，通过比较2-硝基苯肼(2-NPH)，3-硝基苯肼(3-NPH)、4-硝基苯肼(4-NPH)和2，4-二硝基苯肼(2,4-DNPH)这几种硝基苯肼类衍生化试剂，发现此类衍生化试剂与4-硝基苯甲醛衍生化反应后生成的产物在UV/Vis光区的吸收发生了红移，可使药物和衍生化试剂本身的干扰最小化，因此提供了一种衍生化HPLC-UV/Vis法测定4-硝基苯甲醛的方法。本专利技术的另一目的是提供衍生化HPLC-UV/Vis法测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛的方法。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一种衍生化HPLC-UV/Vis法测定4-硝基苯甲醛的方法，包含以下步骤：步骤(1)、使用硝基苯肼类衍生化试剂对4-硝基苯甲醛衍生化生成在紫外可见光区(350～450nm)有较强吸收的产物；步骤(2)、利用HPLC-UV/Vis法，基于反相分配色谱法原理，在紫外可见光区(350～450nm)测定步骤(1)中衍生化反应产物中4-硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4-硝基苯甲醛的定性或定量检测。优选的，所述的衍生化HPLC-UV/Vis法测定4-硝基苯甲醛的方法，包含以下步骤：步骤(1)、在20～80℃条件下，以乙腈-水为反应体系，使用硝基苯肼类衍生化试剂对4-硝基苯甲醛衍生化反应生成在紫外可见光区(390～440nm)有较强吸收的产物；步骤(2)、利用HPLC-UV/Vis法，基于反相分配色谱法原理在紫外可见光区(390～440nm)测定步骤(1)中衍生化反应产物中4-硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4-硝基苯甲醛的定性或定量检测。所述的硝基苯肼类衍生化试剂选自2-硝基苯肼盐酸盐、3-硝基苯肼盐酸盐、4-硝基苯肼盐酸盐和2,4-二硝基苯肼盐酸盐中的任意一种，优选为3-硝基苯肼盐酸盐。所述的衍生化反应的条件：以乙腈-水＝10:90～90:10(V:V)为反应体系，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为0.5～2mg/mL，反应温度为60～80℃，反应时间为30～60min。优选的，所述的衍生化反应的条件：以乙腈-水＝70:30(V:V)为反应体系，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为500μg/mL，反应温度为60℃，反应时间为30min。衍生化试剂相对于4-硝基苯甲醛是过量的，反应体系中3-硝基苯肼盐酸盐和4-硝基苯甲醛的质量比为100～2000:1，优选为500:1。优选的，所述的HPLC-UV/Vis法：采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于350～450nm之间，优选位于390～440nm之间，进一步优选位于390～400nm之间。进一步优选的，所述的HPLC-UV/Vis法使用的仪器为ShimadzuLC20AT液相色谱仪，该色谱仪配置有在线真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和LC-solution色谱工作站；色谱柱采用250mm×4.6mm,5μm的迪马DiamonsilC18色谱柱；进样量：20μL；流动相流速：1.0mL/min；等度洗脱：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸，A:B＝75:25(V:V)，色谱运行时间为10min；柱温：30℃；检测波长：397n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.衍生化HPLC‑UV/Vis法测定4‑硝基苯甲醛的方法，其特征在于包含以下步骤：步骤(1)、使用硝基苯肼类衍生化试剂对4‑硝基苯甲醛衍生化生成在紫外可见光区350～450nm有较强吸收的产物；步骤(2)、利用HPLC‑UV/Vis法，基于反相分配色谱法原理，在紫外可见光区350～450nm测定步骤(1)中获得的4‑硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4‑硝基苯甲醛的定性或定量检测。

【技术特征摘要】
1.衍生化HPLC-UV/Vis法测定4-硝基苯甲醛的方法，其特征在于包含以下步骤：步骤(1)、使用硝基苯肼类衍生化试剂对4-硝基苯甲醛衍生化生成在紫外可见光区350～450nm有较强吸收的产物；步骤(2)、利用HPLC-UV/Vis法，基于反相分配色谱法原理，在紫外可见光区350～450nm测定步骤(1)中获得的4-硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4-硝基苯甲醛的定性或定量检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包含以下步骤：步骤(1)、以乙腈-水为反应体系，使用硝基苯肼类衍生化试剂对4-硝基苯甲醛衍生化反应生成在紫外可见光区390～440nm有较强吸收的产物；步骤(2)、利用HPLC-UV/Vis法，基于反相分配色谱法原理在紫外可见光区390～440nm测定步骤(1)中获得的4-硝基苯甲醛的衍生化产物，从而实现对4-硝基苯甲醛的定性或定量检测。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的硝基苯肼类衍生化试剂选自2-硝基苯肼盐酸盐、3-硝基苯肼盐酸盐、4-硝基苯肼盐酸盐和2，4-二硝基苯肼盐酸盐中的任意一种，优选为3-硝基苯肼盐酸盐。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于反应体系中乙腈的体积浓度为10％～90％，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为0.5～2mg/mL，反应温度为60～80℃，反应时间为30～60min；优选为反应体系中乙腈的体积浓度为70％，3-硝基苯肼盐酸盐在反应体系中的浓度为500μg/mL，衍生化反应温度为60℃，衍生化反应时间为30min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的HPLC-UV/Vis法采用HPLC色谱仪；采用反相分配色谱法；以非极性键合相为固定相，采用极性流动相，检测波长位于350～450nm之间，优选位于390～440nm之间，进一步优选位于390～400nm之间。6.权利要求1～5中任一项所述的方法在测定氯霉素或其制剂中4-硝基苯甲醛中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑枫，罗岚，刘晶，柳文媛，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32