检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用，以及fen1基因的抑制剂在制备抑制肝癌侵袭转移的药物中的应用。本发明专利技术首次发现fen1基因与肝癌的发生发展相关：本发明专利技术通过干扰实验证明改变FEN1的表达水平可以影响细胞的侵袭和转移；动物实验显示FEN1的表达可以促进肝癌的转移。

【技术实现步骤摘要】
检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用。
技术介绍
原发性肝癌，致死率位列全球高致死性肿瘤的第三位，但肝癌的早期发现较难、肝癌切除术后复发和转移率较高一直严重影响着肝癌病人的治疗效果与生存期。原发性肝癌的病因和发病机制尚未确定。目前认为与肝硬化、病毒性肝炎以及黄曲霉素等化学致癌物质和环境因素有关。临床表现主要包括以下几个方面：1.肝区疼痛：半数以上病人肝区疼痛为首发症状，多为持续性钝痛、刺痛或胀痛。主要是由于肿瘤迅速生长，使肝包膜张力增加所致。位于肝右叶顶部的癌肿累及横膈，则疼痛可牵涉至右肩背部。当肝癌结节发生坏死、破裂，可引起腹腔内出血，出现腹膜刺激征等急腹症表现。2.全身和消化道症状：主要表现为乏力、消瘦、食欲减退、腹胀等。部分病人可伴有恶心、呕吐、发热、腹泻等症状。晚期则出现贫血、黄疸、腹水、下肢水肿、皮下出血及恶病质等。3.肝大：肝大呈进行性，质地坚硬，边缘不规则，表面凹凸不平呈大小结节或巨块。4.肝癌转移症状：肝癌如发生肺、骨、脑等处转移，可产生相应症状。少数病人可有低血糖症、红细胞增多症、高血钙和高胆固醇血症等特殊表现。原发性肝癌的并发症主要有肝性昏迷、上消化道出血、癌肿破裂出血及继发感染。随着原发性肝癌早期诊断、早期治疗和肝外科手术技术的进步，总体疗效有所提高。但肝癌即使获得根治性切除，5年内仍有60％～70％的病人出现转移复发，所以尽早发现肝癌的复发和转移十分必要。至今没有很好地生物标志物可以用于早期诊断及预测肿瘤的侵袭转移。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了检测FEN1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用。本专利技术研究发现改变FEN1的表达水平可以影响细胞的侵袭和转移。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于早期诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用。作为优选，检测fen1基因表达水平的试剂为包括特异性识别fen1基因的探针的试剂，或包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂，或包括特异性结合FEN1蛋白的抗体的免疫组化试剂或Westernblot试剂。作为优选，包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂中，特异性扩增fen1基因的引物由SEQIDNO：1所示的上游引物和SEQIDNO：2所示的下游引物组成。SEQIDNO：1所示的上游引物序列如下：5′-CTGTGGACCTCATCCAGAAGCA-3′SEQIDNO：2所示的下游引物序列如下：5′-CCAGCACCTCAGGTTCCAAGA-3′作为优选，包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂反应体系(25μL)为：作为优选，包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂扩增程序为：本专利技术还提供了fen1基因的抑制剂在制备抑制肝癌侵袭转移的药物中的应用。作为优选，fen1基因的抑制剂为fen1基因的shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸中的一种，或其构建物。作为优选，shRNA的扩增引物序列组成如下：由SEQIDNO：3所示的上游引物和SEQIDNO：4所示的下游引物组成的引物；SEQIDNO：3所示的上游引物序列如下：CCGGGCCCGTGTATGTCTTTGATTTCAAGAGAATCAAAGACATACACGGGCTTTTTTGSEQIDNO：4所示的下游引物序列如下：AATTCAAAAAAGCCCGTGTATGTCTTTGATTCTCTTGAAATCAAAGACATACACGGGC或者由SEQIDNO：5所示的上游引物和SEQIDNO：6所示的下游引物组成的引物；SEQIDNO：5所示的上游引物序列如下：CCGGCCTCATGGGCATCCCTTATTTCAAGAGAATAAGGGATGCCCATGAGGTTTTTTGSEQIDNO：6所示的下游引物序列如下：AATTCAAAAAACCTCATGGGCATCCCTTATTCTCTTGAAATAAGGGATGCCCATGAGG或者由SEQIDNO：7所示的上游引物和SEQIDNO：8所示的下游引物组成的引物；SEQIDNO：7所示的上游引物序列如下：CCGGGCTCACTCTCTTCAGCTAATTCAAGAGATTAGCTGAAGAGAGTGAGCTTTTTTGSEQIDNO：8所示的下游引物序列如下：AATTCAAAAAAGCTCACTCTCTTCAGCTAATCTCTTGAATTAGCTGAAGAGAGTGAGC或者由SEQIDNO：9所示的上游引物和SEQIDNO：10所示的下游引物组成的引物。SEQIDNO：9所示的上游引物序列如下：CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGSEQIDNO：10所示的下游引物序列如下：AATTCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA作为优选，构建物为克隆入shRNA的慢病毒干扰质粒载体。作为优选，克隆入shRNA的慢病毒干扰质粒载体为pLKD-CMV-EGFR-2A-Puro-U6-shRNA(FEN1)。作为优选，肝癌侵袭转移的药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。本专利技术提供了检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于早期诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用，以及fen1基因的抑制剂在制备抑制肝癌侵袭转移的药物中的应用。本专利技术具有的技术效果为：本专利技术首次发现fen1基因与肝癌的发生发展相关。本专利技术通过干扰实验证明改变FEN1的表达水平可以影响细胞的侵袭和转移。动物实验显示FEN1的表达可以促进肝癌的转移。具体验证试验及结果如下：本专利技术通过qPCR检测fen1基因在肝癌细胞与正常肝细胞的表达情况，结果显示：与正常肝细胞系相比，FEN1基因在肝癌细胞中表达均上升，除SK-HEP1其他都有统计学意义(p＜0.05)；本专利技术利用qPCR检测fen1在肝癌患者癌与癌旁中的表达情况，结果显示：与癌旁组织相比，fen1基因在肝癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p＜0.05)；本专利技术利用免疫组化检测FEN1在肝癌患者癌与癌旁中的表达情况，结果显示：与癌旁组织相比，肝癌中FEN1的表达明显升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)；本专利技术检测转染sh-RNA对肝癌细胞FEN1的表达情况，结果显示：sh1-FEN1、sh2-FEN1、sh3-FEN1组均能够显著降低FEN1的表达，差异具有统计学意义(p＜0.05)。其中尤以sh3-FEN1干扰效果最佳；本专利技术通过Transwell小室检测FEN1对肝癌细胞迁移和侵袭的影响，结果显示：转染了shRNA-FEN1的肝癌细胞侵袭和迁移能力明显下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)。说明FEN1能够促进肝癌细胞的迁徙和侵袭；本专利技术通过动物模型检测FEN1的表达对肝癌肺转移的影响，结果显示：转染了sh3-FEN1组，即FEN1敲低组，肿瘤生长速度明显慢于对照组；肿瘤的重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测fen1基因表达水平的试剂为包括特异性识别fen1基因的探针的试剂，或包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂，或包括特异性结合FEN1蛋白的抗体的免疫组化试剂或Westernblot试剂。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂中，特异性扩增fen1基因的引物由SEQIDNO：1所示的上游引物和SEQIDNO：2所示的下游引物组成。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂反应体系为：5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述包括特异性扩增fen1基因的引物的实时定量PCR试剂扩增程序为：6.fen1基因的抑制剂在制备抑制肝癌侵袭...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤慧，李传飞，胡鹏，任红，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50