以玉米秸秆酸处理水解液生产微生物油脂的方法技术

本发明专利技术公开了一种以玉米秸秆酸处理水解液生产微生物油脂的方法。该方法先采用稀硫酸对玉米秸秆进行预处理，再利用复配纤维素酶水解预处理后的秸秆干物，得到玉米秸秆酶解液，然后以玉米秸秆酶解液为原料配制发酵培养基进行产油微生物解脂耶氏酵母NRRL Y‑1095的发酵培养，菌体经破碎后采用氯仿‑甲醇法，提取得到油脂。本发明专利技术方法利用稀硫酸预处理玉米秸秆以及复配纤维素酶水解预处理后的秸秆干物得到木质纤维素水解液，通过解脂耶氏酵母NRRL Y‑1095直接发酵玉米秸秆水解液，不需要进行脱毒处理，方法简便，微生物油脂的提取量高。

【技术实现步骤摘要】
以玉米秸秆酸处理水解液生产微生物油脂的方法
本专利技术涉及微生物发酵
，涉及一种微生物油脂的生产方法，具体涉及一种以玉米秸秆酸处理水解液生产微生物油脂的方法。
技术介绍
生物柴油是生物质能的一种，是植物油、动物油、废弃油脂和微生物油脂等经脂转化工艺制成的可再生性柴油燃料，作为绿色可再生能源，具有极大的发展潜力。虽然生物柴油来源广泛，但多数生物柴油的成本过高，制约其进一步发展应用，因此需要开发廉价原料油脂。微生物油脂作为生物柴油的一种，多为长链脂肪酸的单基烷酯且大多数为C16或C18化合物，燃烧热值高，可替代柴油使用，由于微生物油脂的脂肪酸组成和一般植物油基本相同，被认为是生物柴油生产的可再生替代原料。玉米秸秆作为农业废弃物，具有数量多、价格低廉的特点。玉米秸秆中含有丰富的木质纤维素，其中的纤维素和半纤维素可成为微生物发酵的重要糖分来源。木质纤维素经水解后可生成葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等，可为微生物生长提供碳源。因此，玉米秸秆是制备微生物油脂的理想原料。目前，已有一些利用微生物发酵玉米秸秆水解液生产油脂的方法，但大多需要进行原料的脱毒处理，方法较为繁复，成本较高。中国专利申请CN104630293公开了一种利用木材水解液制备微生物油脂的方法，首先将木材进行热水处理得到木材水解液，将木材水解液去毒后添加盐分，调pH至7～9，灭菌后制备成培养基；再在培养基中接入产油脂菌的种子液发酵，收集菌体进行油脂交换反应得到微生物油脂。该方法需对水解液进行脱毒操作，存在糖分流失、工艺繁琐等问题。中国专利CN102634549通过对酵母进行驯化得到油脂酵母，驯化后的油脂酵母在木质纤维素水解液中的油脂得率系数为13～20％，比驯化前提高20％～30％。该方法虽然不需要对木质纤维素水解液进行脱毒处理，但是驯化后的酵母有潜在的产油表型不稳定及存在负突变的风险。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种方法简单、操作便捷、降低微生物制备成本、提高农业废弃物应用价值、绿色环保无污染的以玉米秸秆酸处理水解液生产微生物油脂的方法，该方法直接发酵玉米秸秆稀酸预处理水解液生产微生物油脂。实现本专利技术目的的技术方案如下：以玉米秸秆酸处理水解液生产微生物油脂的方法，具体步骤如下：步骤1，玉米秸秆粉末加入到质量浓度为1％～3.5％的稀硫酸溶液，在110～200℃下预处理15～30min，过滤得到玉米秸秆干物；步骤2，在玉米秸秆干物中加入纤维素酶与木聚糖酶组成的复配酶溶液，水解得到玉米秸秆水解液；步骤3，在玉米秸秆水解液中加入终浓度为6.8～10.2g/L的酵母粉，1.1～3.3g/L的(NH)2SO4，3～9g/L的KH2PO4和Mg2SO4·7H2O，溶解后调节pH至5～7，灭菌，得到发酵培养基；步骤4，在发酵培养基接种解脂耶氏酵母NRRLY-1095，动态培养，发酵结束后，离心收集菌体，菌体经破碎后采用氯仿-甲醇法提取得到油脂。优选地，步骤1中，所述的玉米秸秆粉末与稀硫酸溶液的质量比为1:9。优选地，步骤2中，所述的纤维素酶与木聚糖酶的质量比为7:3。优选地，步骤2中，所述的玉米秸秆水解液制备的具体步骤如下：将玉米秸秆干物烘干后，按复配酶按照20mg酶蛋白/g葡聚糖的酶加量，在50℃、250rpm条件下水解预处理后的秸秆干物24小时，并在6000r/min转速下离心15min，得到玉米秸秆水解液。优选地，步骤3中，所述的调节pH至5.8。优选地，步骤3中，所述的调节pH所用的碱为NaOH。优选地，步骤4中，所述的解脂耶氏酵母NRRLY-1095的接种量为5～7％，发酵条件为30℃，180～250r/min，培养时间为96～120小时。优选地，步骤4中，所述的离心速度为8000～12000rpm，离心时间为5～10min。优选地，步骤4中，所述的氯仿-甲醇法提取油脂的具体步骤为：在湿菌体中加入4mol/LHCl，于78℃水浴处理1.5～2h，冷却后，加入甲醇，充分振荡，按甲醇：氯仿＝1：1(V/V)加入氯仿，振荡，离心，收集氯仿层，在剩余混合液中再加入氯仿，充分振荡，离心，收集氯仿层，合并氯仿提取液，将收集到的氯仿提取液烘干，冷却得到油脂。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术利用稀硫酸对玉米秸秆进行预处理后，使用复配酶水解预处理后的秸秆干物得到玉米秸秆水解液，通过微生物直接发酵得到含量较高的微生物油脂，得到的生物量为18.96g/L，油脂产量为2.66g/L，总糖利用率超过95％。(2)本专利技术以玉米秸秆为原料，来源广泛，价格低廉，且无需对水解液进行脱毒处理，简化了操作步骤，降低了微生物油脂的生产成本，同时提高了农副产品的应用价值。附图说明图1为实施例1中稀酸预处理后玉米秸秆的酶解产糖和发酵产油脂曲线图。图2为实施例3中稀酸预处理后玉米秸秆的酶解产糖和发酵产油脂曲线图。图3为实施例5中稀酸预处理后玉米秸秆的酶解产糖和发酵产油脂曲线图。图4为实施例7中稀酸预处理后玉米秸秆的酶解产糖和发酵产油脂曲线图。图5为实施例9中稀酸预处理后玉米秸秆的酶解产糖和发酵产油脂曲线图。图6为对比例1中3种酵母发酵稀酸预处理后玉米秸秆的酶解液产油脂的表型与实施例1中的解脂耶氏酵母NRRLY-1095的产油脂表型的对比图。图7为对比例2中解脂耶氏酵母ATCC201249发酵稀酸预处理后玉米秸秆的酶解液产油脂的过程图。图8为对比例3中稀酸预处理后玉米秸秆的酶解产糖和发酵产油脂曲线图。图9为对比例4中稀酸预处理后玉米秸秆的酶解产糖和发酵产油脂曲线图。图10为对比例5中稀酸预处理后玉米秸秆的酶解产糖和发酵产油脂曲线图。具体实施方式下面通过具体实施例和附图对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。实施例1一种直接发酵稀硫酸预处理玉米秸秆的酶解液生产微生物油脂的方法，具体步骤如下：(1)玉米秸秆水解液的制备将玉米秸秆粉碎至碎片状，放入高温高压反应釜，按照玉米秸秆与稀硫酸溶液质量比(w/w)为1:9的比例加入质量百分数为1％的稀硫酸溶液，于160℃下预处理15min。预处理后的秸秆在60℃烘箱中烘至含水量10％。烘干后的秸秆加水至干物浓度为10％(w/w)，用盐酸调节pH至4.8左右，按40mg酶蛋白/g葡聚糖加入酶(复配酶，纤维素酶：木聚糖酶＝7：3)，在50℃、250rpm条件下反应96小时，期间测水解液中葡萄糖、木糖的含量。4000r/min离心20min，得到玉米秸秆稀酸预处理水解液，及木质纤维素水解液。用高效液相色谱法测水解液中糖含量。(2)产油微生物的发酵培养a)菌株的活化：在无菌条件下从甘油冻管中取出的菌液进行连续两代培养活化，传代时保证下一瓶发酵液初始OD600为1。培养基条件为60g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉。菌的活化在250mL摇瓶中进行，装液量为50mL，在30℃、200rpm摇床条件每代培养24小时左右，接种时种子菌OD600在20左右(指数生长期)，接种量为5％(v/v)。所用的培养基在121℃下灭菌20分钟。b)发酵培养：在步骤(1)制得的水解液中终浓度按10.2g/L加入酵母粉，按2.2g/L加入(NH4)2SO4，按9g/L加入MgSO4·7H20，按9g/L加入KH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.以玉米秸秆酸处理水解液生产微生物油脂的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，玉米秸秆粉末加入到质量浓度为1％～3.5％的稀硫酸溶液，在110～200℃下预处理15～30min，过滤得到玉米秸秆干物；步骤2，在玉米秸秆干物中加入纤维素酶与木聚糖酶组成的复配酶溶液，水解得到玉米秸秆水解液；步骤3，在玉米秸秆水解液中加入终浓度为6.8～10.2g/L的酵母粉，1.1～3.3g/L的(NH)2SO4，3～9g/L的KH2PO4和Mg2SO4·7H2O，溶解后调节pH至5～7，灭菌，得到发酵培养基；步骤4，在发酵培养基接种解脂耶氏酵母NRRL Y‑1095，动态培养，发酵结束后，离心收集菌体，菌体经破碎后采用氯仿‑甲醇法提取得到油脂。

【技术特征摘要】
1.以玉米秸秆酸处理水解液生产微生物油脂的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，玉米秸秆粉末加入到质量浓度为1％～3.5％的稀硫酸溶液，在110～200℃下预处理15～30min，过滤得到玉米秸秆干物；步骤2，在玉米秸秆干物中加入纤维素酶与木聚糖酶组成的复配酶溶液，水解得到玉米秸秆水解液；步骤3，在玉米秸秆水解液中加入终浓度为6.8～10.2g/L的酵母粉，1.1～3.3g/L的(NH)2SO4，3～9g/L的KH2PO4和Mg2SO4·7H2O，溶解后调节pH至5～7，灭菌，得到发酵培养基；步骤4，在发酵培养基接种解脂耶氏酵母NRRLY-1095，动态培养，发酵结束后，离心收集菌体，菌体经破碎后采用氯仿-甲醇法提取得到油脂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述的玉米秸秆粉末与稀硫酸溶液的质量比为1:9。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述的纤维素酶与木聚糖酶的质量比为7:3。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述的玉米秸秆水解液制备的具体步骤如下：将玉米秸秆干物烘干后，按复配酶按照20mg酶蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：王泽迪，苟一雄，方木林，柏霖，金明杰，闻志强，许召贤，翟睿，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32