一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法与应用技术

一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法与应用，涉及海洋微生物。将菌株Schizochytrium sp.MYA1381经过平板和二级种子活化，制备种子液，再接种于发酵培养基，在裂殖壶菌生长的不同阶段加入氟啶酮。所述氟啶酮可在提高裂殖壶菌EPA含量中应用。首次将氟啶酮应用到脂肪酸合成途径的调控中，为提高裂殖壶菌中EPA含量提供了新的思路。通过添加氟啶酮，显著提高了裂殖壶菌油脂中EPA的含量，相比于未添加提高了42.31％。为使用氟啶酮提高裂殖壶菌内EPA含量提供了基础。

A control method and application for improving EPA content in pombe

A regulation method and application for improving the content of EPA in fissure bacteria, involving marine microorganisms. The strain Schizochytrium sp. MYA1381 was activated by plate and secondary seeds to prepare seed liquid, then inoculated in fermentation medium, and fluoropyridone was added at different stages of the growth of Schizochytrium sp. MYA1381. The fluorine pyridone can be applied in improving the content of EPA. For the first time, Fluridone was applied to the regulation of fatty acid synthesis pathway, which provided a new idea to improve the EPA content in S. The content of EPA in the oil of S. mellea was significantly increased by adding fluridone, which was 42.31% higher than that without fluridone. It provides a basis for improving the content of EPA in pombe by using fluidizone.

【技术实现步骤摘要】
一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法与应用
本专利技术涉及海洋微生物，尤其是涉及一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法与应用。
技术介绍
多不饱和脂肪酸(PUFA)是指分子结构中含有两个或两个以上不饱和双键且碳原子数目在20个以上的脂肪酸。依据双键离甲基端的距离可分为ω-3系列、ω-6系列和ω-9系列多不饱和脂肪酸。其中ω-3系列多不饱和脂肪酸具有防治心脑血管疾病、促进脑组织及视网膜的正常生长发育等生理作用，是人体健康的必需脂肪酸(GillandRao1997；Das.etal.2003)。ω-3系列多不饱和脂肪酸主要包括二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五稀酸(EPA)。EPA的分子为式C20H30O2，具有促进血液循环，防止胆固醇和脂肪在动脉壁上积聚的功能。因此被广泛应用于冠状动脉心脏病、高血压和炎症等疾病的治疗(Nettleton.etal.1995)。深海鱼油富含ω-3多不饱和脂肪酸，是EPA的传统商业来源。然而，因其鱼腥味重、EPA含量较低、脂肪酸组成复杂、且从鱼油中分离EPA是一项复杂且高成本的过程，很难满足工业化生产及市场的需求。与传统鱼油来源相比，微生物发酵法生产EPA具有生长速度快、易于规模化培养、不饱和脂肪酸含量高且组成简单及易于分离纯化等优点，具有广阔的应用前景，因而微生物法发酵生产EPA已逐步替代了传统的鱼油EPA来源(Yazawa.etal.1996)。裂殖壶菌因高产DHA而被广泛研究(YaguchiandTanaka1997)，而裂殖壶菌除产DHA外，也能合成EPA等多不饱和脂肪酸(Ren.etal.2018)，具有很大的商业前景。但目前EPA在裂殖壶菌中的含量还很低。关于裂殖壶菌生产多不饱和脂肪酸的研究主要集中在优良菌株的筛选、DHA的生物合成、培养基及培养条件的优化和工业化大规模生产工艺的探索上(Ling.etal.2015)，而对EPA的研究很少。故本专利技术通过在培养过程中补加外源添加物调控裂殖壶菌的细胞代谢，从而提高EPA的含量。氟啶酮是一种白色晶体，微溶于水，易溶于有机溶剂，是脱落酸生物合成的抑制剂，具有促进种子于不利的高温条件下萌发的作用(苏贺等.2016)。同时它也具有抑制类胡萝卜素合成的能力，因此被广泛用作除草剂(Bartels.etal.1978)。中国专利CN106676127A公开一种酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及应用，包括如下步骤：(1)以裂殖壶菌的基因组为DNA模板，用上游引物对和下游引物对分别PCR扩增KS基因的上游片段UKS和下游片段DKS；(2)将上游片段UKS和下游片段DKS与敲除载体连接，构建重组敲除质粒；(3)将上述重组敲除质粒电转化裂殖壶菌，用抗性平板筛选，并经PCR抗性基因序列验证，得转化子，即所述酮基合成酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌。本专利技术提供了裂殖壶菌敲除基因的工程菌的构建方法构，建了敲除FabA基因裂殖壶菌重组菌，该工程菌产多不饱和脂肪酸的能力比出发菌株中所占总油脂的比例减少了43％，而16碳和18碳饱和脂肪酸的生产量增加29％。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法。本专利技术的另一目在于提供氟啶酮在提高裂殖壶菌EPA含量中的应用。所述提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法的具体步骤如下：将菌株Schizochytriumsp.MYA1381经过平板和二级种子活化，制备种子液，再接种于发酵培养基，在裂殖壶菌生长的不同阶段加入氟啶酮。所述菌株Schizochytriumsp.MYA1381从美国模式菌种收集中心(AmericanTypeCultureCollection)购买。所述裂殖壶菌生长的不同阶段可为第0h，24h，48h。油脂合成初期为培养24h，发酵稳定期为培养120h。所述平板的固体培养基(g/L)的组成可为：葡萄糖30，酵母粉10，琼脂15，无机盐成分，pH调至6.5，所述无机盐的组成(g/L)可为：Na2SO412，MgSO42，KH2PO41，(NH4)2SO41，K2SO40.65，KCl0.5，CaCl2.2H2O0.17。所述二级种子活化的种子培养基(g/L)的组成可为：葡萄糖30，酵母粉10，无机盐成分，pH调至6.5，所述无机盐的组成(g/L)可为：Na2SO412，MgSO42，KH2PO41，(NH4)2SO41，K2SO40.65，KCl0.5，CaCl2.2H2O0.17。所述发酵培养基(g/L)的组成可为：葡萄糖90，谷氨酸钠5，玉米浆粉5，无机盐成分、微量元素1mL和维生素1mL，pH调至6.5，所述无机盐的组成(g/L)可为：Na2SO412，MgSO42，KH2PO41，(NH4)2SO41，K2SO40.65，KCl0.5，CaCl2.2H2O0.17；所述微量元素的组成(mg/L)可为：FeSO4·7H2O10，泛酸钙3.2，MnCl2·4H2O3，ZnSO4·7H2O3，NiSO4·6H2O2，CuSO4·5H2O2，CoCl2·6H2O0.04，Na2MoO4·2H2O0.04；所述维生素的组成(mg/L)可为：VB19.5，VB120.1。所述氟啶酮的质量浓度可为50mg/L。所述氟啶酮可在提高裂殖壶菌EPA含量中应用。在裂殖壶菌的培养基中加入50mg/L氟啶酮。在裂殖壶菌生长的第0h，24h，48h加入氟啶酮。在裂殖壶菌生长的第24h加入50mg/L氟啶酮，分析氟啶酮对裂殖壶菌整个生长阶段的生物量、油脂及EPA含量的影响。本专利技术调控原理如下：在裂殖壶菌生长的不同阶段添加氟啶酮，通过对稳定期生物量，油脂及各脂肪酸含量的分析，确定最优的添加时间。在最优的添加时间添加氟啶酮，之后每24h取样，考虑到氟啶酮可能延缓裂殖壶菌生长，因此取样到稳定期之后的24h，分析氟啶酮对整个发酵过程生物量，油脂及各脂肪酸含量的影响。本专利技术首次将氟啶酮应用到脂肪酸合成途径的调控中，为提高裂殖壶菌中EPA含量提供了新的思路。本专利技术具有以下突出效果：1)本专利技术首次提出了在裂殖壶菌生长的过程中添加氟啶酮，为提高裂殖壶菌油脂中EPA含量提供了一条新思路。2)通过添加氟啶酮，显著提高了裂殖壶菌油脂中EPA的含量，相比于未添加提高了42.31％。为使用氟啶酮提高裂殖壶菌内EPA含量提供了基础。附图说明图1为不同生长阶段添加氟啶酮对裂殖壶菌生物量及油脂含量的影响。图2为油脂合成初期添加氟啶酮对裂殖壶菌生物量的影响。图3为油脂合成初期添加氟啶酮对裂殖壶菌总油的影响。图4为油脂合成初期添加氟啶酮对裂殖壶菌EPA占总脂肪酸比重的影响。具体实施方式以下实施例将结合附图对本专利技术作进一步的说明。以下实施例中使用的裂殖壶菌菌株购买自美国模式菌种收集中心(AmericanTypeCultureCollection)，命名Schizochytriumsp.MYA1381。以下实施例中裂殖壶菌的培养方法：种子于固体培养基活化后，接于一级种子培养基中，200rpm，28℃，24h。按2％的接种量接于二级种子培养基，200rpm，28℃，24h。按2％接种量接于含100ml发酵液的500ml锥形瓶中，200rpm，28℃。以下实施例中所用的培养基配方如下：固体培养基(g/L)：葡萄糖30，酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法，其特征在于其具体步骤如下：将菌株Schizochytrium sp.MYA1381经过平板和二级种子活化，制备种子液，再接种于发酵培养基，在裂殖壶菌生长的不同阶段加入氟啶酮。

【技术特征摘要】
1.一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法，其特征在于其具体步骤如下：将菌株Schizochytriumsp.MYA1381经过平板和二级种子活化，制备种子液，再接种于发酵培养基，在裂殖壶菌生长的不同阶段加入氟啶酮。2.如权利要求1所述一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法，其特征在于所述裂殖壶菌生长的不同阶段为第0h，24h，48h。3.如权利要求1所述一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法，其特征在于油脂合成初期为培养24h，发酵稳定期为培养120h。4.如权利要求1所述一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法，其特征在于所述平板的固体培养基的组成为：葡萄糖30，酵母粉10，琼脂15，无机盐，单位为g/L，pH调至6.5，所述无机盐的组成为：Na2SO412，MgSO42，KH2PO41，(NH4)2SO41，K2SO40.65，KCl0.5，CaCl2.2H2O0.17，单位为g/L。5.如权利要求1所述一种提高裂殖壶菌中EPA含量的调控方法，其特征在于所述二级种子活化的种子培养基的组成为：葡萄糖30，酵母粉10，无机盐，单位为g/L，pH调至6.5，所述无机盐的组成为：Na2SO412，MgSO42，KH2PO41，(NH4)2SO41，K2SO40.65，KCl0.5，CaCl2.2H2O0.17，单位为g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌雪萍，李俊，卢英华，何宁，李娜，陈翠雪，潘雪珊，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35