一种FerritinH、Bcl2及EGFP基因联合修饰的神经干细胞制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种FerritinH、Bcl2及EGFP基因联合修饰的神经干细胞（NSCs）制备方法及应用。本发明专利技术构建的过表达慢病毒能安全有效地对NSCs进行三基因联合修饰，修饰后的干细胞过表达Bcl2，提升了移植后NSCs的抗凋亡及生存能力，增加有效存活干细胞数量，改善了脑梗死治疗的效果；通过FerritinH及EGFP报告基因成像，在活体水平实现对NSCs的磁共振及荧光成像双模态示踪，实现对移植后NSCs的实时、动态、无创、系统监测，为促进干细胞治疗临床转化提供实验依据，为深入阐明神经干细胞作用机制提供新的手段，在神经系统病变的干细胞替代治疗或转基因治疗方面均具有重要的科学意义和临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种FerritinH、Bcl2及EGFP基因联合修饰的神经干细胞制备方法及应用
本专利技术涉及基因工程与生物医学工程
，更具体地，涉及一种FerritinH、Bcl2及EGFP基因联合修饰的神经干细胞制备方法及应用。
技术介绍
脑梗死又称缺血性卒中，中医称之为卒中或中风。本病由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。脑梗死依据发病机制的不同分为脑血栓形成、脑栓塞和腔隙性脑梗死等主要类型。其中脑血栓形成是脑梗死最常见的类型，约占全部脑梗死的60％，因而通常所说的‘脑梗死’实际上指的是脑血栓形成。本病的病死率约为10％，致残率可达50％以上。存活者的复发率高达40％，脑梗死复发可严重削弱患者的日常生活和社会功能，而且可明显增加死亡率。基因工程，又称基因拼接技术和DNA重组技术，在体外将分离到的或合成的目的基因，通过与质粒、病毒等载体重组连接，然后将其导入不含该基因的受体细胞，使受体细胞产生新的基因产物或获得新的遗传特性。基于基因工程的基因治疗，能取代机体致病的突变基因，有目的地抑制异常基因表达或重新开启己关闭的基因，是遗传病、肿瘤、癌症等重大疾病的一种理想的治疗模式。慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-I(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的载体，它能相对定点整合到染色体的特定位置，转导的目的基因能整合至靶细胞基因组，具有长期表达、免疫反应小等优点，在分裂和非分裂细胞中都能高效表达，慢病毒载体安全性高，在干细胞基因工程中具有优势。基于干细胞的细胞治疗或基因治疗是再生医学的新模式。神经干细胞(NSCs)移植是神经系统损伤和退行性疾病的极具前景的新治疗策略。动物实验表明NSCs移植治疗脑梗死具有确切、明显的促神经功能修复效果，但初步临床实验中干细胞治疗效果并不确切，部分实验中患者神经功能恢复效果并不显著。其最直接原因是移植后干细胞所处微环境诱导干细胞大量凋亡，干细胞的低存活率限制了其再生修复能力。此外，在活体水平对移植入体内的干细胞进行示踪，动态监测干细胞体内存活、分布、迁移及转归，是干细胞治疗临床转化的必然需求，但是却一直未能有突破性进展。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，利用基因工程技术，成功构建FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒，转染大鼠神经干细胞(NSCs)后获得基因工程化干细胞FerritinH-Bcl2-EGFP-NSCs。FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒能安全、有效地对NSCs进行FerritinH、Bcl2及EGFP三基因联合修饰，获得的基因工程化干细胞FerritinH-Bcl2-EGFP-NSCs不仅通过过表达Bcl2提升了移植后NSCs的抗凋亡及生存能力，增加有效存活干细胞数量，改善治疗脑梗死的效果；而且通过FerritinH及EGFP报告基因成像，在活体水平实现对NSCs的磁共振及荧光成像双模态示踪，实现对移植后NSCs的实时、动态、无创、系统监测。本专利技术的第一个目的是提供一种基因修饰的可示踪神经干细胞的制备方法。本专利技术的第二个目的是提供以上任一所述制备方法制备得到的基因工程化的可示踪神经干细胞FerritinH-Bcl2-EGFP-NSCs本专利技术的第三个目的是提供所述的融合基因FerritinH-T2A-Bcl2、重组质粒、FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒和/或基因工程化的可示踪神经干细胞FerritinH-Bcl2-EGFP-NSCs在制备治疗脑梗死的医学上可接受的制剂中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：本专利技术采用基因工程技术，制备Bcl2抗凋亡基因、FerritinHMR报告基因及EGFP基因过表达慢病毒载体，对NSCs进行FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP基因修饰后移植于大鼠脑梗死模型，增强NSCs自身抗凋亡能力，利用FerritinH基因实现干细胞MR可视化，利用EGFP基因实现干细胞荧光成像，对NSCs移植后的存活、定居、迁移等生物学行为进行MRI及光学双模态成像活体示踪，探讨通过抗凋亡修饰提高NSCs移植治疗效果的可行性，以及MRI报告基因及光学双模态成像示踪NSCs移植后生物学行为的可行性，并通过与组织病理学对照，揭示了NSCs促进脑梗死修复的潜在机制。因此，本专利技术要求保护一种基因工程化的可示踪神经干细胞的制备方法，包括以下步骤：S1.合成融合基因FerritinH-T2A-Bcl2，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的；S2.将融合基因FerritinH-T2A-Bcl2插入含有EGFP基因的慢病毒表达载体，得到重组质粒；S3.将重组质粒转染宿主细胞，制备FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒；S4.将FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒转染神经干细胞，得到基因工程化的可示踪神经干细胞。所述神经干细胞可以是从已经建立细胞系的诱导性多能干细胞进一步诱导分化得到的，或者直接采用已经建立的成熟的商品化的神经干细胞。优选地，慢病毒表达载体为GV218载体。优选地，宿主细胞为293T细胞。优选地，步骤S2中，线性化载体DNA与融合基因FerritinH-T2A-Bcl2DNA的摩尔比为1：(3～9)。优选地，步骤S4中，MOI指数为10。优选地，步骤S4中，转染时间为24h。最优选地，所述制备方法包括以下步骤：S1.以化学合成方法合成融合基因FerritinH-T2A-Bcl2，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；S2.以步骤S1中合成的将融合基因FerritinH-T2A-Bcl2为模板，以SEQIDNO：2～3所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，扩增的到的片段经过回收纯化后与已经线性化的慢病毒表达载体GV218进行连接反应，将融合基因FerritinH-T2A-Bcl2插入慢病毒表达载体GV218得到重组质粒，其中，插入位点位于Ubi和EGFP之间的多克隆位点中，线性化载体DNA与融合基因FerritinH-T2A-Bcl2DNA的摩尔比为1：(3～9)；S3.将重组质粒转染宿主细胞293T细胞，制备FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒；S4.将FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒转染神经干细胞，得到基因工程化的可示踪神经干细胞FerritinH-Bcl2-EGFP-NSCs，其中，MOI指数为10，转染时间为24h。以上任一所述制备方法制备得到的基因工程化的可示踪神经干细胞。以上所述基因修饰的可示踪神经干细胞，该神经干细胞同时过表达FerritinH、Bcl2及EGFP基因。以上所述的融合基因FerritinH-T2A-Bcl2、重组质粒、FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒和/或基因工程化的可示踪神经干细胞在制备治疗脑梗死的医学上可接受的制剂中的应用，均属于本专利技术的保护范围。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒载体构建成功，能将FerritinH、Bcl2及EGFP基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因工程化的可示踪神经干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 合成融合基因FerritinH‑T2A‑Bcl2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；S2. 将融合基因FerritinH‑T2A‑Bcl2插入含有EGFP基因的慢病毒表达载体，得到重组质粒；S3. 将重组质粒转染宿主细胞，制备FerritinH‑T2A‑Bcl2‑EGFP过表达慢病毒；S4. 将FerritinH‑T2A‑Bcl2‑EGFP过表达慢病毒转染神经干细胞，得到基因工程化的可示踪神经干细胞FerritinH‑Bcl2‑EGFP‑NSCs。

【技术特征摘要】
1.一种基因工程化的可示踪神经干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.合成融合基因FerritinH-T2A-Bcl2，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；S2.将融合基因FerritinH-T2A-Bcl2插入含有EGFP基因的慢病毒表达载体，得到重组质粒；S3.将重组质粒转染宿主细胞，制备FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒；S4.将FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒转染神经干细胞，得到基因工程化的可示踪神经干细胞FerritinH-Bcl2-EGFP-NSCs。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，慢病毒表达载体为GV218载体。3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，宿主细胞为293T细胞。4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，线性化载...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈君，张芳，毛家骥，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44