一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组及试剂盒，本发明专利技术属于动物病毒学和分子生物学技术领域。该试剂盒包括SEQ ID1~6所示的引物序列，还包括了2×F8 Fastlong PCR MasterMix、cDNA模板和灭菌水。本发明专利技术提供的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒采用多重PCR扩增，三种病变相似且同为DNA病毒的病毒一次检测，检测总时间控制在2小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组及试剂盒
本专利技术属于动物病毒学和分子生物学
，具体为针对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型一步法三重PCR的检测引物组、检测试剂盒及应用。
技术介绍
猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）为一种共价闭合、单股环状DNA病毒，是迄今发现最小动物病毒。2015年前，全球范围内仅发现PCV1和PCV2两个基因型。其中，PCV1被认为是猪肾细胞PK-15污染物，但不产生细胞病变效应，对猪无致病性。PCV2能引起猪圆环病毒相关疾病（PCVAD），主要有断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎（PNP）和肠炎等。临床上PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪肺炎支原体(M.hyo)等病原体混合感染。同时，感染PCV2后还容易继发细菌感染，给养猪业造成巨大经济损失。近年来PCV2流行毒株由PCV2a向PCV2b，继而向PCV2d的转变，病毒的致病力逐渐变强，对养猪业的危害加重。2015年6月，美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发PDNS疫情。患病母猪厌食、皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似临床症状。Palinski等借助新一代测序(NGS)技术，从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新病毒，该病毒与圆环病毒科病毒具有类似基因组结构和遗传相似性，但与其他圆环病毒衣壳蛋自氨基酸序列同源性低于70%，根据国际病毒分类委员会(ICTV)圆环病毒分类标准圈，将其归类为一种新型圆环病毒，命名为PCV3。作为新动物病原体，PCV3对猪致病性和在PCVAD中作用以及现有商品化PCV2疫苗对其免疫效果等有待进一步研究。目前已有PCV3在美国、韩国、巴西、意大利、波兰以及中国的华南、华中和华北多省市流行。自20世纪90年代以来，PCV2便一直威胁着养猪业的发展，且近年来PCV2逐渐呈现出多亚型共同流行的趋势，使PCV2防控更加困难。同时，PCV3的出现使猪圆环病毒病更加复杂化。PCV1虽然不产生病变,但广泛存在于猪体内及猪的传代细胞中，其存在可能会影响PCV2和PCV3的增殖及致病性。因此，研究建立一种特异、快速的PCV1/2/3多重PCR检测方法，了解PCV1/2/3的流行情况，从而有效防控猪圆环病毒病的发生与流行，具有重要现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决上述技术问题，提供一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组及试剂盒，该试剂盒能够快速区分PCV1、PCV2和PCV3，灵敏感高、特异性强，从而有效防控猪圆环病毒病的发生和流行。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组，所述多重PCR检测引物组包括PCV1检测引物组、PCV2检测引物组和PCV3检测引物组；所述PCV1检测引物组由具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物组成；所述PCV2检测引物组由具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的下游引物组成；所述PCV3检测引物组由具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:6所示核苷酸序列的下游引物组成。优选的，所述PCV1检测引物组是依据PCV1的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为409bp；所述PCV2检测引物组是依据PCV2的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为1173bp；所述PCV3检测引物组是依据PCV3的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为669bp。优选的，所述多重PCR检测引物组的退火温度为56.1℃。优选的，所述多重PCR检测引物组在制备猪圆环病毒分型检测试剂盒的应用。本专利技术提供一种如以上所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒，包括具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6所示核苷酸序列的下游引物。优选的，还包括2×F8FastlongPCRMasterMix、cDNA模板和灭菌水。优选的，所述的多重PCR检测试剂盒中PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性10s，56.1℃复性10s，72℃延伸10s，30个循环；最后72℃延伸3min。优选的，所述PCR检测试剂盒的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示引物使用浓度为25μmol/L。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒采用多重PCR扩增，三种病变相似且同为DNA病毒的病毒一次检测，检测总时间控制在2小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本专利技术能彻底解决PCV1、PCV2和PCV3引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测，亦适用于流行病学调查。本专利技术提供了三对针对PCV1、PCV2和PCV3的特异性引物组，PCV1-P1/PCV1-P2为猪圆环病毒1型特异性扩增引物组，PCV2-P1/PCV2-P2为猪圆环病毒2型特异性扩增引物组，PCV3-P1/PCV3-P2为猪圆环病毒3型特异性扩增引物组，利用其制成的多重试剂盒能快速、特异的检测出猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型中的单一病毒以及三者的混合病毒，猪圆环病毒1型出现409bp一个条带，猪圆环病毒2型出现1173bp一个条带，猪圆环病毒3型出现669bp一个条带，猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型两种病毒混合样品出现409bp、1173bp、669bp三个条带。本专利技术的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒对PCV1、PCV2、PCV3的检测极限分别为1.10×10-5µg/μL、1.37×10-5µg/μL和3.67×10-6µg/μL，表明本专利技术的猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型和3型的多重PCR检测试剂盒在检测猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、3型时具有较高的灵敏度。本专利技术的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。本专利技术提供的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本专利技术PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本专利技术所得的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒实用性和适用性良好。附图说明图1是本专利技术试剂盒目的基因的PCR扩增结果，其中M：DNA分子质量标准；1：PCV1、PCV2、PCV3三阳性组织样本；2：PCV1阳性组织样本；3：PCV2阳性组织样本；4：PCV3阳性组织样本；5：阴性对照。图2是本专利技术试剂盒PCR的不同退火温度结果，其中M：DNA分子质量标准；1：50.0℃；2：50.7℃；3：51.9℃；4：53本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组包括PCV1检测引物组、PCV2检测引物组和PCV3检测引物组；所述PCV1检测引物组由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；所述PCV2检测引物组由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4 所示核苷酸序列的下游引物组成；所述PCV3检测引物组由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:6 所示核苷酸序列的下游引物组成。

【技术特征摘要】
1.一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组包括PCV1检测引物组、PCV2检测引物组和PCV3检测引物组；所述PCV1检测引物组由具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物组成；所述PCV2检测引物组由具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的下游引物组成；所述PCV3检测引物组由具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO:6所示核苷酸序列的下游引物组成。2.根据权利要求1所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述PCV1检测引物组是依据PCV1的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为409bp；所述PCV2检测引物组是依据PCV2的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为1173bp；所述PCV3检测引物组是依据PCV3的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为669bp。3.根据权利要求1所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组的退火温度为56.1℃。4.根据权利要求1所述快速区分PCV1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦毅斌，卢冰霞，赵武，刘磊，何颖，陈忠伟，段群棚，周英宁，李斌，梁家幸，苏乾莲，闭炳芬，蒋冬福，卢敬专，李茂宁，侯韶毅，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西,45