一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种生成细胞的方法，具体涉及一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用，属于生物技术领域；本发明专利技术所述方法将iPS细胞消化为单细胞，利用三维培养板生成形态和大小均一的拟胚体，将分化前14天早期诱导过程由2D平面贴壁改为3D悬浮培养，减少了分化过程中上皮样细胞发生的比例，提高了黑素细胞的分化效率，对分化前拟胚体的选择、单细胞消化时间点以及培养基成分均进行了优化，改善了黑素细胞的增殖状态；本发明专利技术所获得的黑素细胞在体外具有与正常黑素细胞高度接近的特征，而在体内移植过程中具有显著优于正常黑素细胞的特性。

【技术实现步骤摘要】
一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用
本专利技术涉及一种生成细胞的方法，具体涉及一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用，属于生物

技术介绍
黑素细胞是一种唯一能生成黑色素以保护皮肤细胞抵抗紫外线的细胞类型。人类黑素细胞能够直接从表皮分离获得，然而，其在表皮中的数量极其有限，加上在体外增殖能力弱等特点，大大限制了黑素细胞在自体细胞移植治疗、药物筛选等方面的应用。除表皮之外，黑素细胞还能够通过其他途径分化获得，如黑素干细胞和黑素前体细胞、真皮干细胞、毛囊干细胞、毛囊外毛根鞘干细胞、胚胎神经嵴干细胞以及胚胎干细胞等。然而，这些方法存在各自的缺点，如黑素干细胞、真皮干细胞及毛囊相关的干细胞在皮肤中的数量极少，同时不具有无限增殖的能力，因此获得的黑素细胞数量十分有限。而胚胎来源的干细胞虽然能够无限增殖，但存在伦理争议，而且无法获得用于患者移植的自体黑素细胞。此外，通过重编程的手段也能够使皮肤成纤维细胞或角质形成细胞直接转分化，获得具有一定功能的黑素细胞。但是目前的转分化系统效率极低，加上获得的细胞功能与正常黑素细胞存在一定差距，因此应用受到限制。诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPS细胞)具有无限增殖和多向分化能力，目前已有多个研究发现，在特定因子的作用下，iPS细胞在体外可被诱导分化为具有正常功能的黑素细胞。与其他来源相比，iPS细胞具有多方面的优势：1.通过微创甚至无创取材，可建立患者自体iPS细胞，通过进一步分化可获得自体黑素细胞；2.无限增殖的特性能够生成患者需要的足够数量的黑素细胞；3.不存在伦理问题；4.保留患者遗传特性，能够应用于研究特定患者的发病机制以及药物筛选，实现个体化治疗。利用已有报道的iPS细胞向黑素细胞分化的方案时发现，在生成黑素细胞的同时会产生大量上皮样细胞。这些上皮样细胞不但比例高，而且增殖速度快，大大影响了黑素细胞的增殖，从而在数次传代后时常不能获得成熟的黑素细胞；导致这一低效率的原因主要有两方面：1.传统多利用机械消化法或胰酶消化法获得拟胚体，其大小和形态高度不均一；2.传统方法中整个分化过程都是在2D平面上进行，这容易导致上皮样细胞的大量且快速地增殖。
技术实现思路
针对现有黑素细胞的诱导分化方案中拟胚体大小形态不均一，分化效率低下，分化同时伴有大量上皮样细胞生成，在数次传代后时常不能获得成熟的黑素细胞的技术问题，本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种生成自体黑素细胞的新方法，本方法采用一种基于3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：具体步骤包括如下：a．单细胞法制作拟胚体：iPS细胞克隆生长，加入iPS单细胞消化酶进行消化，加入mTeSR培养基，吹打成iPS单细胞悬液，离心后弃上清液，加入mTeSR培养基重悬计数，将iPS单细胞接种至三维培养板内，添加ROCK抑制剂；培养24小时后得到形态大小均一的拟胚体；将拟胚体轻轻吹打吸出，转移至低黏附板中继续维持悬浮培养，每天换液；步骤a中所述iPS单细胞消化酶为ACCUTASETM，所述iPS单细胞接种至三维培养板是接种至24孔ElplasiaTM三维板中，每孔接种密度为5×105个细胞；ROCK抑制剂为Y27632；所述继续维持培养是培养时间5-10天,拟胚体直径达到300-500μm；b．3D悬浮诱导分化：（1）3D早期诱导：将步骤a中得到的转移至低黏附板中继续维持培养的拟胚体放入分化培养基中进行早期诱导分化，早期诱导分化时拟胚体在低黏附板中悬浮；（2）中期诱导贴壁:将上述步骤b（1）中早期诱导分化后的拟胚体转移至纤维粘连蛋白(fibronectin)包被的培养板中，中期贴壁培养，分化培养基组分不变，拟胚体贴壁生长；（3）后期诱导:将上述步骤b（2）中贴壁培养后的拟胚体用消化酶消化成单细胞，接种至纤维粘连蛋白包被过的培养板中，在优化后的分化培养基中进行后期成熟诱导，当细胞密度达90%时，用消化酶消化传代，分化第35-42天时，得到成熟黑素细胞。步骤b（1）所述的早期诱导分化时间为14天，步骤b（2）所述的中期诱导贴壁培养时间为7天。步骤b（3）中所述的贴壁培养后的拟胚体为诱导分化21天的拟胚体，所述接种为接种密度是2×104/cm2。步骤b（3）中所述优化后的分化培养基包括：体积百分比为50%的L-Wnt3a细胞上清液、30%的低糖DMEM、20%的MCDB201培养基、0.05μM地塞米松（dexamethasone）、1×胰岛素-转铁蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium）、1mg/ml亚油酸-牛血清白蛋白（linoleicacid-bovineserumalbumin）、10-4M抗坏血酸（L-ascorbicacid）、50ng/ml干细胞因子（SCF）、100nMEDN3、20pM霍乱毒素（choleratoxin）、4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、0.5%胎牛血清（FBS）。与现有技术相比较，本专利技术的有益效果：传统2D平面诱导分化系统中拟胚体分化成大量上皮样细胞，树突状细胞所占比例极少，在单细胞消化后，扁平、多角形的上皮样细胞比例高且增殖快，而树突状的细胞比例少且增殖速度慢，因此在数次传代后，时常不能获得成熟的黑素细胞。本专利技术所述方法将早期诱导分化过程从2D平面诱导改为3D悬浮培养，在贴壁后发现拟胚体周边有大量的树突状细胞生成，而上皮样形态的细胞几乎观察不到；使用优化的后期分化培养基，这些树突状细胞保持快速的增殖能力，经过数次传代，可获得大量成熟的黑素细胞。本专利技术所述制备方法制备的黑素细胞具有优良的性能优势：本专利技术获得的黑素细胞在体外特征上与人体正常黑素细胞高度接近；将本专利技术制备的黑素细胞移植到免疫缺陷型小鼠的皮肤内，发现黑素细胞在体内功能上要显著优于正常黑素细胞，更利于应用在患者自体细胞移植治疗色素缺失性疾病如白癜风中，同时，也利于应用于体外制作3D皮肤模型研究患者发病机制及个体化药物筛选等方面。附图说明图1是传统2D平面贴壁法诱导分化黑素细胞的形态图；图中，A为采用传统机械法获得的拟胚体形态图；B为拟胚体转移至纤维粘连蛋白包被的培养板后贴壁分化21天时的形态图；C为分化21天的拟胚体进行单细胞消化后的细胞形态图；D为经过2次传代后的细胞形态图；比例尺：A，500μm；B-D，200μm。图2是利用3D悬浮诱导iPS细胞生成黑素细胞的形态图；图中，A为iPS单细胞接种至三维培养板中的形态图；B为添加ROCK抑制剂24小时后形成的拟胚体的形态图；C为拟胚体形成第7天的形态图；D为在3D悬浮诱导分化第14天的形态图；Ea为诱导分化第21天（贴壁第7天）的形态图；Eb为图Ea的局部放大图；F为诱导分化第28天的细胞形态图；G为诱导分化第35天的黑素样细胞形态图；比例尺：Ea,500μm，其余均为200μm。图3是选择不同培养天数和大小的拟胚体进行3D悬浮诱导分化的对比图；图中，A为培养天数小于3天，直径小于200μm的拟胚体细胞形态图；B为A中的拟胚体在分化第14天细胞形态图；C为A中的拟胚体在分化第21天细胞形态图；D为培养天数大于1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：a．单细胞法制作拟胚体：iPS细胞克隆生长，加入iPS单细胞消化酶，加入mTeSR培养基，吹打成iPS单细胞悬液，离心后弃上清液，加入mTeSR培养基重悬计数获得iPS单细胞，将iPS单细胞接种至三维培养板内培养，添加ROCK抑制剂，培养得到形态大小均一的拟胚体；将拟胚体轻轻吹打吸出，转移至低黏附板中继续维持培养，每天换液；b．3D悬浮诱导分化：（1）3D早期诱导：将步骤a中得到的拟胚体放入分化培养基中进行早期诱导分化；（2）中期诱导贴壁:将上述步骤b（1）中早期诱导分化后的拟胚体转移至纤维粘连蛋白包被的培养板中，中期贴壁培养，分化培养基组分不变,拟胚体贴壁生长；（3）后期诱导:将上述步骤b（2）中贴壁培养后的拟胚体用消化酶消化成单细胞，接种至纤维粘连蛋白包被过的培养板中，在优化后的分化培养基中进行后期成熟诱导，当细胞密度达90%时，用消化酶消化传代，分化第35‑42天时，得到成熟黑素细胞。

【技术特征摘要】
1.一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：a．单细胞法制作拟胚体：iPS细胞克隆生长，加入iPS单细胞消化酶，加入mTeSR培养基，吹打成iPS单细胞悬液，离心后弃上清液，加入mTeSR培养基重悬计数获得iPS单细胞，将iPS单细胞接种至三维培养板内培养，添加ROCK抑制剂，培养得到形态大小均一的拟胚体；将拟胚体轻轻吹打吸出，转移至低黏附板中继续维持培养，每天换液；b．3D悬浮诱导分化：（1）3D早期诱导：将步骤a中得到的拟胚体放入分化培养基中进行早期诱导分化；（2）中期诱导贴壁:将上述步骤b（1）中早期诱导分化后的拟胚体转移至纤维粘连蛋白包被的培养板中，中期贴壁培养，分化培养基组分不变,拟胚体贴壁生长；（3）后期诱导:将上述步骤b（2）中贴壁培养后的拟胚体用消化酶消化成单细胞，接种至纤维粘连蛋白包被过的培养板中，在优化后的分化培养基中进行后期成熟诱导，当细胞密度达90%时，用消化酶消化传代，分化第35-42天时，得到成熟黑素细胞。2.根据权利要求1所述的一种生成自体黑素细胞的方法，其特征在于，步骤a中所述iPS单细胞接种至三维培养板是接种至24孔ElplasiaTM三维板中，每孔接种密度为5×105个细胞。3.根据权利要求1所述的一种生成自体黑素细胞的方法，其特征在于，步骤a中所述维持培养是培养时间为5-10天，拟...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘莉萍，李遇梅，郑允文，郭宁宁，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32