赖氨酸脱羧酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法技术

本发明专利技术涉及生物酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法，具体涉及适用于长度高于2000bp的基因如赖氨酸脱羧酶基因的易错PCR定向进化突变体文库的构建方法及高或低活力突变株高通量筛选的方法。本发明专利技术采用易错PCR分段突变、PCR整合、DpnI酶消化、系列pH指示剂指示pH变化的方法，解决了常规易错PCR方法无法有效构建长片段基因突变体文库、连接效率低、pH变化超过指示剂指示范围的难题，为从赖氨酸脱羧酶的突变体文库中筛选出酶活提高或降低的突变株提供了快速、简便的方法。

【技术实现步骤摘要】
赖氨酸脱羧酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法
本专利技术涉及生物酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法，具体涉及适用于长度高于2000bp的基因如赖氨酸脱羧酶基因的易错PCR定向进化突变体文库的构建方法及高或低活力突变株高通量筛选的方法。
技术介绍
戊二胺(1,5-戊二胺)，又叫尸胺，因其首次分离于腐败的尸体中因此得名。因为其在农业、医学及工业上具有广泛的应用而越来越受到关注。在工业上其可以与二元酸进行聚合反应生成新型尼龙—一种优质的高分子材料，用于替代对石油依赖度非常大的聚酰胺尼龙6.6。戊二胺可以通过生物法制备，其方法主要有两种，一种是一步法制备，即通过细胞的自身代谢系统中的赖氨酸合成途径将葡萄糖转化成赖氨酸后再通过赖氨酸脱羧酶(EC4.1.1.18)将赖氨酸脱羧生成戊二胺，整个过程在细胞内统一完成；另一种方法是通过细胞表达大量的赖氨酸脱羧酶，然后在发酵液中添加外源的赖氨酸，使表达的赖氨酸脱羧酶将赖氨酸脱羧生成戊二胺。在这两种方法中，关键步骤之一是通过赖氨酸脱羧酶将赖氨酸上的羧基脱去，得到戊二胺。在这个过程中赖氨酸脱羧酶催化能力的高低直接影响赖氨酸脱羧的效率。为提高在催化过程中的催化效率，通常采取的办法可以包括增加酶量，但是这种方法增加了成本。另外由于一般使用的是含有酶的细胞，增加反应中的细胞量的会增加后处理的成本。提高酶活是提高催化能力的另一种方法。提高酶活是指提高单位质量或重量的酶的催化活力或能力。提高酶活的方法有优化反应体系中的组分、pH或者通过分子改造，对酶蛋白的氨基酸序列进行改造。分子改造赖氨酸脱羧酶可以有两种方法，一种是基于蛋白分子三维结构及催化机理的理性设计，包含理性计算、定点突变等；另一种是基于高通量筛选的定向进化。定向进化是模仿达尔文进化论，人为地对蛋白分子进行随机的突变，构建突变体文库，再在人为的筛选压力下对突变体文库进行筛选，得到预期目标的突变体。易错PCR定向进化是构建突变体文库的最为简便基础的方法，其基本原理是通过调整反应体系中的锰离子、镁离子及四种不同的dNTPs改变taq酶的保真性，在使用taq酶扩增目标基因的过程中随机地引入突变。但是常规的基于taq酶的易错PCR也存在其缺点，主要是其适用于长度在1000bp左右的基因片段，而对于长度高于2000bp的基因则较难扩增出来。高通量筛选方法则是根据酶催化底物或产物特征，建立易于快速检测或区分的指示方法。在一些需求中，则需要酶活适度降低的赖氨酸脱羧酶。本领域依然存在对适用于构建基于易错PCR的长度高于2000bp的基因如赖氨酸脱羧酶基因的突变体文库的方法的需求，存在提高或降低赖氨酸脱羧酶酶活的迫切需求。
技术实现思路
本专利技术的一个方面涉及一种大片段基因突变体文库的构建方法，其利用易错PCR进行，其特征在于利用易错PCR分段突变所述大片段基因，然后将分段突变产生的片段化的文库通过PCR整合的方法整合到质粒上，任选地，用DpnI酶消化没有整合片段的质粒，其中大片段基因是指长度大于1500个碱基对(bp)的基因，分段突变是指将大片段基因按照其位置分段，并对每一分段进行突变，然后通过PCR整合的方法将各突变片段整合起来，分段的长度为大于500bp对小于1500bp，同时要求能够通过一步易错PCR建立突变，PCR整合是指将含有上述大片段基因的质粒作为模板，将上述各突变分段作为引物，利用PCR的方法扩增整个质粒，以用突变片段替换质粒上基因中对应的未突变片段。大于3000bp的片段可以进行多次分段突变并整合实现。所述大片段基因的长度可以为1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp、2000bp、2200bp、2400bp、2600bp、2800bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp或更大。所述突变体文库的规模可以为10、50、100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000或更大。在一些实施方案中，所述大片段基因编码生物酶，优选地，所述生物酶为赖氨酸脱羧酶，优选地，所述赖氨酸脱羧酶为微生物来源的赖氨酸脱羧酶，更优选地，所述赖氨酸脱羧酶为大肠杆菌(Escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)来源的赖氨酸脱羧酶。在一些实施方案中，易错PCR的反应条件为本领域的常规易错PCR反应条件，优选地，易错PCR反应体系中的锰离子的浓度为0.2-0.3mM。本专利技术的第二方面涉及一种高或低活力赖氨酸脱羧酶突变株的高通量筛选方法，其包括步骤：1)将根据上述第一方面所述的构建方法获得的突变体文库转化宿主微生物，所述宿主微生物无特定要求，只要能表达赖氨酸脱羧酶即可，优选地，所述宿主微生物为蜂房哈夫尼菌或枯草芽孢杆菌，优选地，所述宿主微生物为表达T7启动子控制的基因的菌株，优选地，所述宿主微生物为大肠杆菌；2)将转化有突变体文库的宿主微生物涂布在质粒对应抗性的固体培养基上，获得单菌落，所述质粒无特殊要求，只要有表达元件如启动子、终止子，可表达赖氨酸脱羧酶基因即可，优选地，所述质粒为pET30a，优选地，所述抗性为卡那霉素抗性，优选地，所述固体培养基为LB培养基；3)培养单菌落；4)向单菌落培养物中加入赖氨酸溶液和磷酸吡哆醛并反应0.5-5小时，例如0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时或5小时；5)终止反应后加入单pH指示剂或混合pH指示剂，根据颜色变化挑出高或低活力赖氨酸脱羧酶突变株。在一些实施方案中，本专利技术的高通量筛选方法还包括将颜色变化明显的克隆挑出后培养，测定最终赖氨酸的转化率并与对照比较的步骤。在一些实施方案中，所述步骤3)、4)和/或5)在深孔板中进行，优选地，所述深孔板为12孔、24孔、48孔、96孔、192孔或384孔深孔板。在一些实施方案中，所述赖氨酸溶液的溶剂为水、柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液，优选地，所述赖氨酸溶液的溶剂为醋酸缓冲液，优选地，0.4M的醋酸缓冲液，优选地，赖氨酸溶液的浓度为10％(质量百分数，下同)，优选地，赖氨酸溶液的初始pH为4.0-6.5，优选5.0-6.0。在一些实施方案中，所述单指示剂选自溴甲酚紫、溴百里酚蓝、中性红、亚甲基蓝、酚红，或所述混合指示剂选自溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1(质量比，下同)、中性红/亚甲基蓝＝1/1、溴百里酚蓝/酚红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝3/1，其中混合指示剂优选溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1、中性红/亚甲基蓝＝1/1、溴百里酚蓝/酚红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝3/1，更优选溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1，溴百里酚蓝/酚红＝1/1，溴百里酚蓝/中性红＝3/1。在一些实施方案中，单菌落培养物与10％赖氨酸溶液的体积比为1:1-5:1，优选2:1-4:1。在一些实施方案中，转化率通过核磁共振的方法测定。换言之，本专利技术采用PCR整合的方法建立突变体文库，主要是将利用易错PCR分段突变产生的片段化的文库通过PCR整合的方法整合到质粒上，然后再通过D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大片段基因突变体文库的构建方法，其利用易错PCR进行，其特征在于利用易错PCR分段突变所述大片段基因，然后将分段突变产生的片段化的文库通过PCR整合的方法整合到质粒上，任选地，用DpnI酶消化没有整合片段的质粒，其中大片段基因是指长度大于1500个碱基对的基因，分段突变是指将大片段基因按照其位置分段，并对每一分段进行突变，然后通过PCR整合的方法将各突变片段整合起来，分段的长度为大于500个碱基对小于1500个碱基对，PCR整合是指将含有上述大片段基因的质粒作为模板，将上述各突变分段作为引物，利用PCR的方法扩增整个质粒，以用突变片段替换质粒上基因中对应的未突变片段。

【技术特征摘要】
1.一种大片段基因突变体文库的构建方法，其利用易错PCR进行，其特征在于利用易错PCR分段突变所述大片段基因，然后将分段突变产生的片段化的文库通过PCR整合的方法整合到质粒上，任选地，用DpnI酶消化没有整合片段的质粒，其中大片段基因是指长度大于1500个碱基对的基因，分段突变是指将大片段基因按照其位置分段，并对每一分段进行突变，然后通过PCR整合的方法将各突变片段整合起来，分段的长度为大于500个碱基对小于1500个碱基对，PCR整合是指将含有上述大片段基因的质粒作为模板，将上述各突变分段作为引物，利用PCR的方法扩增整个质粒，以用突变片段替换质粒上基因中对应的未突变片段。2.根据权利要求1所述的构建方法，其中所述大片段基因编码生物酶，优选地，所述生物酶为赖氨酸脱羧酶，优选地，所述赖氨酸脱羧酶为微生物来源的赖氨酸脱羧酶，更优选地，所述赖氨酸脱羧酶为大肠杆菌或哈夫尼菌来源的赖氨酸脱羧酶。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其中易错PCR的反应条件为本领域的常规易错PCR反应条件，优选地，易错PCR反应体系中的锰离子的浓度为0.2-0.3mM。4.一种高或低活力赖氨酸脱羧酶突变株的高通量筛选方法，其包括步骤：1)将根据权利要求2或3所述的构建方法获得的突变体文库转化宿主微生物，优选地，所述宿主微生物为表达T7启动子控制的基因的菌株，优选地，所述宿主微生物为大肠杆菌；2)将转化有突变体文库的宿主微生物涂布在质粒对应抗性的固体培养基上，获得单菌落，优选地，所述质粒为pET30a，优选地，所述抗性为卡那霉素抗性，优选地，所述固体培养基为LB培养基；3)培养单菌落；4)向单菌落培养物中加入赖氨酸溶液和...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆文强，周豪宏，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术研发中心有限公司，凯赛生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31