一种VEGF-A单克隆抗体及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种VEGF‑A单克隆抗体，其重链的氨基酸序列如VH:NP_001273973所示，其轻链的氨基酸序列如VL:AEP60973所示。所述VEGF‑A单克隆抗体具有较高的亲和力，特异性强，在体外具有良好的生物学活性。将本发明专利技术VEGF‑A单抗与VEGF‑A多抗建立的VEGF‑A蛋白检测试剂盒可作为VEGF/VEGFR通路肿瘤靶向药物的疗效评估工具。

A VEGF-A monoclonal antibody and kit

The present invention discloses a monoclonal antibody against vascular endothelial growth factor A. Its heavy chain amino acid sequence is shown in VH: NP_001273973 and its light chain amino acid sequence is shown in VL: AEP60973. The monoclonal antibody against VEGF_A has high affinity, strong specificity and good biological activity in vitro. The detection kit of VEGF_A protein established by the present invention can be used as a therapeutic evaluation tool for tumor targeting drugs through the vascular endothelial growth factor/vascular endothelial growth factor receptor pathway.

【技术实现步骤摘要】
一种VEGF-A单克隆抗体及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种VEGF‐A单克隆抗体及VEGF‐A蛋白检测试剂盒。
技术介绍
血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一种具有高度生物活性的一种二聚体阳离子糖蛋白。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF－F和胎盘生长因子(Placentalgrowthfactor，PlGF)。人类VEGF-A基因定位于6p21.3，由8个外显子和7个内含子构成，全长14Kb。通过基因转录的mRNA不同剪接方式(Alternativesplicing)，编码出4种主要异构体，它们为VEGF121，VEGF165，VEGF189和VEGF206，分别由121、165、189和206个氨基酸组成。VEGF121、VEGF145、VEGF165三种单体是分泌性蛋白质，可以从细胞浆中分泌到细胞外。VEGF145和VEGF165可以和所有内皮细胞的KDR/flk-1受体结合。VEGF165是VEGF家族最主要的异构体，也是生理活性最强的VEGF异构体，研究最为广泛，相应的报导也最多。VEGF是主要介导血管生成(Angiogenesis)和血管发生(Vasculogenesis)的异构体，它是一种强大的特异的内皮细胞有丝分裂素，介导内皮细胞的增殖、出芽、迁移和管腔形成。1994年，KondoNishida等首次证实癌症和VEGF关系，根据Folkman假设实体瘤如果没有新的血管生成，由于受氧和其他营养成分供应的限制，其大小不会超过1-3mm3。血管内皮生长因子(VEGF)是促进肿瘤血管新生的关键性的蛋白因子。此外，越来越多的临床实验也表明，血管内皮细胞功能障碍是实体肿瘤形成的一个重要特点。2004年2月26日，美国罗氏公司生产的通过抑制VEGF-A作用机制的肿瘤治疗药物阿瓦斯汀获得FDA的批准。靶向治疗药物贝伐单抗(Bevacizumab)是VEGF的人源化单抗，能与VEGF‐A各亚型及活性降解产物结合。人源化的贝伐单抗后来被Genentech公司商品化，商品名为Avastin。鉴于贝伐单抗在治疗转移性结直肠癌临床实验中的显著疗效，于2004年被美国食品与药物管理局(FDA)批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌，成为世界上首个获准上市的VEGF抑制剂，目前，FDA已批准贝伐单抗用于转移性结直肠癌、转移性乳腺癌、晚期非小细胞肺癌、转移性肾细胞癌的一线治疗。除此之外，贝伐单抗在肝癌、胃癌、食管癌等其他恶性肿瘤的应用也取得令人鼓舞的结果。2013年，美国Roche/Genentech公司正在进行VEGF‐A检测试剂盒的临床试验，其美国FDA临床试验批准号为NCT01663727。近年来研究表明，肿瘤患者血清中VEGF浓度与肿瘤疾病进展及治疗效果评价和疾病转归等方面有重要关系，在疾病的诊断及预测疾病治疗等方面存在很大的应用价值。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附法、和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，其中化学发光法具有检测线性范围宽、检测仪器简单、操作方便等优点。现有技术中针对VEGF/VEGFR通路靶向药物监测及疗效评估的产品目前国内尚属空白，同类产品其特异性和亲和力等方面还存在进一步的提升可能，基于此，我们开发了VEGF‐A测定试剂盒(化学发光法)及其制备方法。
技术实现思路
为了克服现有中的上述问题，本专利技术提供了一种VEGF‐A单克隆抗体，具有较高的亲和力，在体外具有良好的生物学活性；开发前景广阔。一种VEGF‐A单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区氨基酸序列为：MetAlaGluGlyGlyGlyGlnAsnHisHisGluValValLysPheMetAspValTyrGlnArgSerTyrCysHisProIleGluThrLeuValAspIlePheGlnGluTyrProAspGluIleGluTyrIlePheLysProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsnAspGluGlyLeuGluCysValProThrGluGluSerAsnIleThrMetGlnIleMetArgIleLysProHisGlnGlyGlnHisIleGlyGluMetSerPheLeuGlnHisAsnLysCysGluCysArgProLysLysAspArgAlaArgGlnGluAsnProCysGlyProCysSerGluArgArgLysHisLeuPheValGlnAspProGlnThrCysLysCysSerCysLysAsnThrAspSerArgCysLysAlaArgGlnLeuGluLeuAsnGluArgThrCysArgCysAspLysProArgArgLeuAsn；轻链可变区氨基酸序列为：SerSerAsnGluHisGlyProValLysArgSerSerGlnSerThrLeuGluArgSerGluGlnGlnIleArgAlaAlaSerSerLeuGluGluLeuLeuArgIleThrHisSerGluAspTrpLysLeuTrpArgCysArgLeuArgLeuLysSerPheThrSerMetAspSerArgSerAlaSerHisArgSerThrArgPheAlaAlaThr。进一步地，本专利技术还提供了编码上述轻链可变区和重链可变区氨基酸序列的多核苷酸。进一步地，本专利技术还提供了包含上述多核苷酸的重组DNA表达载体，所述重组DNA表达载体中包含编码VEGF-A单克隆抗体重链可变区、轻链可变区和和抗体恒定区的DNA序列。进一步地，本专利技术提供了包含上述VEGF‐A单克隆抗体的检测试剂盒。该试剂盒制备方法是：以Nunc化学发光反应板为反应支持物，将VEGF‐A单克隆抗体用0.5mPBS稀释至2.5ug/ml，以100ul/孔包被至化学发光空白板中，4℃下24小时后，用0.9％Nacl洗板3次，加入含有1％BSA的0.5molPBS封闭，4℃下12小时后甩干。本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术的VEGF‐A单克隆抗体，具有较高的亲和力，特异性强，在体外具有良好的生物学活性。(2)包含有VEGF‐A单克隆抗体的检测试剂盒检测方法简便、准确性强、成本低。(3)将VEGFa165与VEGF‐A多抗建立VEGF‐A蛋白检测试剂盒可作为VEGF/VEGFR通路肿瘤靶向药物的监测工具。附图说明图1是VEGFa165抗体剂量‐反应体系示意图。图2是VEGFa165抗体质控血清检测散点图。图3是采用本专利技术试剂盒检测两组TACE术前后血清VEGF动态变化情况示意图。具体实施方式借助于下述具体实施方式可更好地理解本专利技术，然而，这些具体实施方式仅用于举例说明本专利技术，不应被解释为对本专利技术的限制。实施例1一、VEGF‐A抗原的制备：(1)根据GenBank数据库中人VEGF-A(KT768148.1)的序列设计一对引物，上游引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种VEGF‐A单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区氨基酸序列为：Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg Leu Asn；轻链可变区氨基酸序列为：Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr。...

【技术特征摘要】
1.一种VEGF‐A单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区氨基酸序列为：MetAlaGluGlyGlyGlyGlnAsnHisHisGluValValLysPheMetAspValTyrGlnArgSerTyrCysHisProIleGluThrLeuValAspIlePheGlnGluTyrProAspGluIleGluTyrIlePheLysProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsnAspGluGlyLeuGluCysValProThrGluGluSerAsnIleThrMetGlnIleMetArgIleLysProHisGlnGlyGlnHisIleGlyGluMetSerPheLeuGlnHisAsnLysCysGluCysArgProLysLysAspArgAlaArgGlnGluAsnProCysGlyProCysSerGluArgArgLysHisLeuPheValGlnAspProGlnThrCysLysCysSerCysLysAsnThrAspSerArgCysLysAlaArgGlnLeuGluLeuAsnGluArgThrCysArgCysAspLysProArgArgLeu...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕鹏辉，
申请(专利权)人：浙江众意生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33