基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物、试剂盒及检测方法。本发明专利技术针对沙门氏菌的特异性靶序列invA保守区的特异区域设计了一对检测引物Ft/Bt和一对加速引物IF/IB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示，该引物保证了检测结果的可靠性。本发明专利技术中还提供了一种基于聚合酶螺旋反应检测沙门氏菌的试剂盒，其具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合中小型单位及现场检测应用的特点。此外，本发明专利技术中还提供了一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的方法，该方法在等温条件下扩增，耗时短，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色后可凭肉眼判断结果。

Primers, kits and detection methods for detection of Salmonella based on polymerase chain reaction

The invention discloses a primer, a kit and a detection method for detecting Salmonella at constant temperature based on polymerase helical reaction. The invention designs a pair of detection primers Ft/Bt and a pair of accelerating primers IF/IB for the specific target sequence invA conservative region of Salmonella, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1-4, which ensures the reliability of detection results. The invention also provides a reagent kit for detecting Salmonella based on polymerase helix reaction, which has the characteristics of high sensitivity, good specificity, simple and fast operation, accurate and reliable results, low detection cost, and is suitable for small and medium-sized units and field detection applications. In addition, the invention also provides a method for detecting Salmonella based on the constant temperature of polymerase screw reaction. The method is amplified under isothermal conditions, and the time consumption is short. The amplified product does not need gel electrophoresis, and can be judged directly by the naked eye after being directly dyed with fluorescent dyes.

【技术实现步骤摘要】
基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物、试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
沙门氏菌是肠杆菌科中一大类重要的食源性致病菌，沙门氏菌引起的中毒病例位居世界各地食物中毒的首位。WHO食源性疾病监控计划显示，欧洲每年约有160000人感染沙门氏菌。每年用于沙门氏菌的防控和治疗费用高达28亿欧元。在某些国家，70％～80％细菌性食物中毒事件是由沙门氏菌引起，引起沙门氏菌中毒食品中，约有90％是肉、蛋、奶等畜牧产品。沙门氏菌感染畜禽后可引发一系列疾病，在动物屠宰过程中，肠道中的致病菌会污染屠宰环境或被带到内脏与体表，成为畜禽肉胴体、畜禽产品污染的重要来源。卫生检测要求中，世界各国普遍规定食品不得检出沙门氏菌。目前，沙门氏菌传统的检测方法大多采用细菌分离，生化鉴定表型方法、基于抗体的免疫学方法等，在快速，敏感与特异性等方面具有局限性。PCR法需要昂贵的循环仪，不适于基层快速检测。而目前应用最广泛的恒温扩增技术-LAMP也有它的局限性，如引物设计复杂、假阳性率高、试剂价高偏高，且由于日本知识产权的保护，我国在转化应用上局限性强。聚合酶螺旋反应(Polyme-raseSpiralReaction，PSR)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。因此，建立一种针对沙门氏菌新型的具有独立知识产权的等温核酸扩增方法具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物。本专利技术的另一目的在于提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物，包括检测引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB，其核苷酸序列如下所示(5’-3’)：检测引物Ft:cacaaagatgataatgatgccTACTGGAAAGGGAAAGCC(SEQIDNO.1)；检测引物Bt：ccgtagtaatagtagaaacacGACAGAGCGGAGGATAAA(SEQIDNO.2)；加速引物IF:TCATCGCACCGTCAAA(SEQIDNO.3)；加速引物IB:TGGCGGTATTTCGGTGGG(SEQIDNO.4)。一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂盒，包括上述基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物。所述的聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物中的各引物(检测引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB)的浓度均为50μM。所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂盒，还包括如下组分：A、2×反应储液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；B、BstDNA聚合酶；C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。组分B中所述的BstDNA聚合酶优选为浓度为8U/μL的BstDNA聚合酶水溶液。组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配置50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mM的氯化锰水溶液；(ii)取15μL50μM的钙黄绿素溶液与9μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:12)。一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.8～2.0；(2)于65℃水浴中保温40～45分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为26μL反应体系：2×反应储液12.5μL，50μM的检测引物Ft和50μM的检测引物Bt各0.8μL，50μM的加速引物IF和50μM的加速引物IB各0.4μL，DNA模板2.0μL，8U/μL的BstDNA聚合酶1.0μL，加水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化：如颜色为黄色，说明待检样品中不含有沙门氏菌；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有沙门氏菌。步骤(2)中所述的检测引物Ft的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，检测引物Bt的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，加速引物IF的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，加速引物IB的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。步骤(2)中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，配置50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mM的氯化锰水溶液；(ii)取15μL50μM的钙黄绿素溶液与9μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术提供基于聚合酶螺旋反应检测沙门氏菌的试剂盒，其具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合中小型单位及现场检测应用的特点。(2)本专利技术中所提供的针对沙门氏菌特异性靶序列invA所设计的聚合酶螺旋检测鉴定体系，解决现有技术中的方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。(3)本专利技术与现有技术相比具有以下优点：可以将检测时间减少到40～45分钟，同传统环介导等温扩增技术相比速断检测周期，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。同时，本专利技术还公开了针对沙门氏菌的特异性靶序列invA(GenebankAccessionNo.DQ644631.1)保守区的特异区域设计了一对检测引物和一对加速引物，从而保证了检测结果的可靠性。其次，本专利技术在等温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，在45分钟就可完成结果判读。此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果。附图说明图1为聚合酶螺旋反应技术检测沙门氏菌的结果及凝胶电泳结果图；其中，图A为聚合酶螺旋反应技术检测沙门氏菌的结果(NG为空白对照，1为沙门氏菌ATCC14028，2为沙门氏菌ATCC29629)；图B为聚合酶螺旋反应技术检测沙门氏菌的凝胶电泳结果(泳道NG为空白对照；泳道1为沙门氏菌ATCC14028，泳道2为沙门氏菌ATCC29629)。图2为特异性检测实验结果的照片图及凝胶电泳结果图；其中，图A为特异性检测实验结果(1：沙门氏菌ATCC14028；2：沙门氏菌ATCC29629；3：大肠杆菌ATCC43895；4：大肠杆菌ATCC438944：5：铜绿假单胞菌ATCC27853；6：单增李斯特菌ATCC19116；7：单增李斯特菌ATCC19114；8：金黄色葡萄球菌ATCC27664；9：干酪乳杆菌GBHM-21；10：阴性对照)；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物，其特征在于：包括检测引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB；其中：检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；加速引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；加速引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物，其特征在于：包括检测引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB；其中：检测引物Ft的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；检测引物Bt的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；加速引物IF的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；加速引物IB的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。2.一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物。3.根据权利要求2所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述的聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物中的各引物的浓度均为50μM。4.根据权利要求2或3所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括如下组分：A、2×反应储液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs；B、BstDNA聚合酶；C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。5.根据权利要求4所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：组分B中所述的BstDNA聚合酶为浓度为8U/μL的BstDNA聚合酶水溶液。6.根据权利要求4所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振波，徐行勇，刘君彦，苗健，苏健裕，刘丽艳，李冰，李琳，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44