一种萨利麝香半抗原、人工抗原的合成方法技术

本发明专利技术涉及一种萨利麝香半抗原、人工抗原的合成方法，萨利麝香与羧甲基羟胺半盐酸、乙酸钠，在甲醇体系中，室温反应提纯后，得到具有羧基的产物，即半抗原Celestolide‑COOH。所得半抗原Celestolide‑COOH分别与载体蛋白偶联，即得到萨利麝香的人工抗原。与现有技术相比，本发明专利技术成功合成了萨利麝香人工抗原，合成步骤简洁、有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必须的人工抗原。

A synthetic method of Sally musk hapten and artificial antigen

The invention relates to a synthetic method of Sally musk hapten and artificial antigen. Sally musk, carboxymethyl hydroxylamine hemichloride and sodium acetate are reacted and purified in methanol system at room temperature to obtain a product with carboxyl group, namely hapten Celestolide_COOH. The obtained hapten, Celestolide_COOH, was coupled with the carrier protein respectively to obtain the artificial antigen of Sally musk. Compared with the prior art, the synthetic method successfully synthesizes Sally musk artificial antigen, the synthetic procedure is simple and effective, and can be completely used in immunoassay, providing the necessary artificial antigen for future research.

【技术实现步骤摘要】
一种萨利麝香半抗原、人工抗原的合成方法
本专利技术涉及一种萨利麝香半抗原、人工抗原的合成方法，属于生物化工

技术介绍
随着人们对香料的需求量急剧增加，以各种花、动物的萃取物为主的天然香料已经远远不能满足人类的需求。直至上世纪50年代，出现天然麝香的替代物人工合成麝香，人工合成麝香以其优雅的芳香气味，优良的定香能力以及低廉的价格，逐渐取代了天然麝香，广泛应用于化妆品、洗涤用品、护肤品、香水等产品中。常见的人工合成麝香按其化学结构可以分硝基麝香化合物、多环麝香化合物和大环麝香化合物三大类，而多环麝香是目前最常用的人工合成麝香。萨利麝香(Celestolide)，作为一种常用的多环麝香，已经进入到全球范围的环境介质中，成为环境中的一种长久存在的污染物。目前，对萨利麝香毒副作用的研究表明，较大剂量的萨利麝香能引起小鼠肝细胞增重；而且水环境中的萨利麝香、佳乐麝香和吐纳麝香等能明显抑制水生生物幼虫的生长发育。基于其潜在的毒性和风险，2008年加拿大环境部发布了环境保护法要求减少多环麝香的使用。在欧洲，欧盟化妆品法规(EC)1223/2009限定化妆品中多环麝香的用量。如何快速有效的检测其环境中的含量始终是环境分析监测方面的研究热点。酶联免疫法具有选择性好，灵敏度高，操作简便，成本低，能够实现快速、高通量检测等优点，然而得到高特异性和亲和性的多克隆抗体是免疫检测的前提，而人工抗原的合成是尤为重要的一步。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种萨利麝香半抗原、人工抗原的合成方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种萨利麝香半抗原的合成方法，其特征在于，萨利麝香与羧甲基羟胺半盐酸、乙酸钠，在甲醇体系中，室温反应提纯后，得到具有羧基的产物，即半抗原Celestolide-COOH。(1)萨利麝香的半抗原Celestolide-COOH的合成：萨利麝香结构式为其半抗原Celestolide-COOH合成的方法具体包括以下步骤：(1)将萨利麝香、羧甲基羟胺半盐酸盐和乙酸钠按摩尔比1：(1-2)：(1-2)混合溶于溶剂中，室温条件下搅拌反应3-4h；(2)旋转蒸发除去溶剂，随后将其溶解在超纯水中，用氢氧化钠调节水层pH值为14后，用有机溶剂洗涤；再用盐酸调节pH值为1，用有机溶剂萃取，加入无水硫酸镁干燥过夜，有机相经减压抽滤后，旋转蒸发除去有机溶剂，得白色结晶体，即人工半抗原Celestolide-COOH；结构式为步骤(1)所述的溶剂包括甲醇、乙醇或丙醇。步骤(2)所述的有机溶剂包括二氯甲烷、四氯化碳、苯、乙酸乙酯、三氯乙烯等。一种萨利麝香人工抗原的合成方法，其特征在于，用活化酯法或混合酸酐法将将权利要求1或2所得半抗原Celestolide-COOH分别与载体蛋白偶联，即得到萨利麝香的人工抗原。所述的载体蛋白为蛋白质BSA，所得人工抗原为人工抗原Celestolide-BSA；所述方法具体包括以下步骤：(1)将萨利麝香半抗原Celestolide-COOH加入N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)使之溶解；(2)将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N′-二环己基碳酰亚胺(DCC)溶于DMF中；其中，萨利麝香半抗原Celestolide-COOH，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，N,N′-二环己基碳酰亚胺(DCC)的摩尔比为1：(1-2)：(1-2)；(3)将含有NHS和DCC的DMF溶液充分搅拌后，逐滴加入到步骤(1)所得萨利麝香半抗原溶液中，室温下搅拌反应6h，低温4℃过夜后，低温离心分离上清液；(4)将蛋白质BSA溶于PBS缓冲液中，配制成10mg/mL的蛋白质BSA溶液，将步骤(3)所得上清液逐滴加入蛋白质BSA溶液中，4℃反应过夜，反应后，将溶液装入透析袋，透析后离心分离上清液，即得萨利麝香人工抗原Celestolide-BSA。步骤(4)所述的透析采用的缓冲液为0.01M，pH7.4的PBS缓冲液，透析时间为3天，每日换水三次。所述的载体蛋白为蛋白质OVA，所得人工抗原为人工抗原Celestolide-OVA；所述方法具体包括以下步骤：(1)将萨利麝香半抗原Celestolide-COOH溶解于DMF中，顺次加入正丁胺和氯甲酸异丁酯，所述的萨利麝香半抗原Celestolide-COOH与正丁胺和氯甲酸异丁酯的摩尔比为1：(1-2)：(1-2)，4℃磁力搅拌3-4h；(2)将蛋白质OVA溶于PBS缓冲液中，配制成10mg/mL的蛋白质OVA溶液，将步骤(1)所得半抗原反应液逐滴缓慢加入到蛋白质OVA溶液中，4℃搅拌反应过夜；(3)反应结束后，装入透析袋透析，低温离心分离上清液，得萨利麝香人工抗原Celestolide-OVA。步骤(3)所述的透析采用的缓冲液为0.01MpH7.4的PBS，透析时间为3天，每天换透析液3次。萨利麝香半抗原、人工抗原的鉴定a、采用核磁共振和红外技术鉴定半抗原。b、人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物种小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。偶联比的测定：首先测定半抗原在其特征吸收峰处和蛋白质的特征吸收峰处的相关摩尔消光系数，以及蛋白质在其特征吸收峰处和半抗原的特征吸收峰处的相关摩尔消光系数，然后分别测定偶联物在半抗原和蛋白质的特征吸收峰处的相关吸光度。计算公式如下：偶联结比公式＝(ε偶联物-ε蛋白质)/ε半抗原＝[(OD偶联物-OD蛋白质)×C半抗原×M蛋白质]/[OD半抗原×M半抗原×C蛋白质]式中ε为摩尔消光系数，OD为光密度，C为浓度，M为摩尔质量分数。与现有技术相比，本专利技术将萨利麝香与羧甲基羟胺半盐酸、乙酸钠，在甲醇体系中，室温反应提纯后，得到具有羧基的产物，即半抗原Celestolide-COOH。该方法工艺简单，反应率高，采用一步反应，且最大限度保留了萨利麝香的化学结构，提高半抗原的特异性，且引入了活性基团-COOH，为后续人工抗原的制备加入连接点。本专利技术成功合成了萨利麝香人工抗原，合成步骤简洁、有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必须的人工抗原。附图说明图1为萨利麝香的半抗原Celestolide-COOH的NMR鉴定图；图2为萨利麝香的半抗原Celestolide-COOH的IR鉴定图；图3为萨利麝香的人工抗原Celestolide-BSA、Celestolide-OVA紫外鉴定图。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1萨利麝香的半抗原Celestolide-COOH合成：称取萨利麝香0.99g(4mmol)，最后称取羧甲基羟胺半盐酸盐0.547g(约5mmol)，乙酸钠0.41g(约5mmol)，将上述三种物质溶于25ml甲醇中，室温条件下搅拌反应3-4h。旋转蒸发除去溶剂，随后将其溶解在超纯水100ml中。用氢氧化钠调节水层pH值为14后，用二氯甲烷200ml洗涤两次后；然后用盐酸调节pH值为1后，用二氯甲烷200ml萃取4次，加入无水硫酸镁干燥过夜。有机相经减压抽滤后，旋转蒸发除去二氯甲烷，得白色结晶体(1.09g，即人工半抗原Celestolide-COOH)，产率约本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种萨利麝香半抗原的合成方法，其特征在于，萨利麝香与羧甲基羟胺半盐酸、乙酸钠，在甲醇体系中，室温反应提纯后，得到具有羧基的产物，即半抗原Celestolide‑COOH。

【技术特征摘要】
1.一种萨利麝香半抗原的合成方法，其特征在于，萨利麝香与羧甲基羟胺半盐酸、乙酸钠，在甲醇体系中，室温反应提纯后，得到具有羧基的产物，即半抗原Celestolide-COOH。2.根据权利要求1所述的萨利麝香半抗原的合成方法，其特征在于，所述的方法具体包括以下步骤：(1)将萨利麝香、羧甲基羟胺半盐酸盐和乙酸钠按摩尔比1：(1-2)：(1-2)混合溶于溶剂中，室温条件下搅拌反应3-4h；(2)旋转蒸发除去溶剂，随后将其溶解在超纯水中，用氢氧化钠调节水层pH值为14后，用有机溶剂洗涤；再用盐酸调节pH值为1，用有机溶剂萃取，加入无水硫酸镁干燥过夜，有机相经减压抽滤后，旋转蒸发除去有机溶剂，得白色结晶体，即人工半抗原Celestolide-COOH。3.根据权利要求1所述的萨利麝香半抗原的合成方法，其特征在于，步骤(1)所述的溶剂包括甲醇、乙醇或丙醇。4.根据权利要求1所述的萨利麝香半抗原的合成方法，其特征在于，步骤(2)所述的有机溶剂包括二氯甲烷、四氯化碳、苯、乙酸乙酯或三氯乙烯。5.一种萨利麝香人工抗原的合成方法，其特征在于，用活化酯法或混合酸酐法将将权利要求1或2所得半抗原Celestolide-COOH分别与载体蛋白偶联，即得到萨利麝香的人工抗原。6.根据权利要求5所述的萨利麝香人工抗原的合成方法，其特征在于，所述的载体蛋白为蛋白质BSA，所得人工抗原为人工抗原Celestolide-BSA；所述方法具体包括以下步骤：(1)将萨利麝香半抗原Celestolide-COOH加入N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)使之溶解；(2)将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N′-二环己基碳酰亚胺(DCC)溶于DMF中；其中，萨利麝香半抗原Celestolide-COOH，N-羟基琥...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄惠生，张晓寒，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31