一种细胞膜成像荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术具体涉及一种细胞膜成像荧光探针，具体为一种糖基取代的苝酰亚胺衍生物细胞膜成像染料。该衍生物一端引入烷基链，一端引入吡喃糖。可在体外自组装成纳米颗粒，进入细胞后，重分布于细胞膜，经激发后可对胞膜特异性成像。该染料与传统胞膜荧光染料相比，具有较好的生物相容性，长效的光和酸稳定性，且制备方法简单，经济，可广泛应用于细胞膜成像研究，特别是弱酸性环境下的肿瘤细胞的细胞膜的成像。

A cell membrane imaging fluorescence probe and its application

The invention relates specifically to a cell membrane imaging fluorescent probe, in particular to a glycosyl substituted perylene imide derivative cell membrane imaging dye. One end of the derivative is an alkyl chain and one end is introduced into a sugar. It can be self-assembled into nanoparticles in vitro, and then re-distributed on the cell membrane after entering the cell. After stimulation, it can be specific imaging of the cell membrane. Compared with traditional membrane fluorescent dyes, this dye has better biocompatibility, long-term light and acid stability, and the preparation method is simple and economical. It can be widely used in cell membrane imaging, especially in weak acid environment.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞膜成像荧光探针及其应用
本专利技术属于分子探针
，具体涉及一种细胞膜成像荧光探针及其应用。
技术介绍
细胞膜又称细胞质膜，是真核细胞中围绕在细胞表面的一层厚度约7.5nm的双层膜。细胞膜不仅在结构上构成了细胞的边界，使细胞形成了稳定的内环境，而且它在细胞与外环境之间的物质运输以及信息、能量交换过程中发挥着重要功能。此外，细胞膜还与细胞贴壁、伸展、分裂、增殖、胞吞、外排、凋亡以及坏死等重要的细胞生物学行为密切相关。而研究人员对细胞膜功能进行研究时，需借助相关工具，其中最常用、最方便、最直观的莫过于细胞膜荧光标记技术。通过使用合适的荧光染料不仅可以确定胞膜位置所在，还可通过荧光变化追踪细胞膜的动态形貌变化，为观察细胞生命过程中的囊泡运输、细胞贴壁、分裂、凋亡和坏死等重要的生命活动提供有效、有力的工具，并对细胞组织工程研究具有极为重要的意义。目前，常用的商品化细胞膜荧光染料根据作用方式可分为以下两种：（1）基于疏水相互作用的荧光探针；（2）基于特异性识别相互作用的荧光探针。基于特异性识别相互作用的荧光探针（如麦胚凝集素分子），可以识别细胞膜表面糖分子的唾液酸残基。由于不同细胞表面的糖分子经常发生变化，以及不同细胞间的唾液酸含量差异，这类染料具有细胞种类依赖性，限制了其广泛应用。基于疏水相互作用的荧光探针（如碳菁类DiO，DiD，DiI和DiA）使用较为广泛，这类荧光探针中含有可以锚定细胞膜的疏水链段，可通过疏水作用与细胞膜结合从而定位于细胞膜。然而这类有机小分子水溶性较差，成像效率低，容易发生光漂白及易被细胞内吞。因而，研究人员开始关注开发两亲性的细胞膜荧光探针，通过同时修饰亲水和疏水基团，可以延长荧光探针在胞膜的驻留时长，提高了其细胞膜成像能力，但合成复杂、稳定性较差、成本较高等限制了其应用。苝酰亚胺衍生物具有光热性能稳定、荧光产率高、不易光漂白及易于修饰等特性，在光电和生物材料方面有着广泛应用。研究人员曾利用表面正负静电作用开发了基于苝酰亚胺衍生物的细胞膜成像试剂，但过多的正电荷易对生物体产生毒害限制了其应用。而且，大多数肿瘤细胞的弱酸微环境也对表面带有正电荷的苝酰亚胺衍生物荧光探针的使用提出了挑战。因此，进一步发展具有高荧光强度和酸稳定性的苝酰亚胺衍生物细胞膜荧光探针对于细胞膜的研究，尤其是肿瘤微环境下细胞膜研究具有非常重要的意义。四川大学兰静波课题组制备酰胺氮原子处含有1,4,7,10-四氮杂环十二烷取代基团的苝酰亚胺衍生物，该化合物可以特异性与Pb2+结合，渗透细胞膜，应用于生物细胞成像技术。其中使用Pb2+与化合物络合可以增加在细胞显像时的荧光强度，但是该络合物在酸性条件稳定较差，易于解离导致其荧光淬灭。由此可以看出，细胞探针在酸性条件下稳定的成像是一个巨大的挑战。
技术实现思路
本专利技术提供了一种细胞膜成像荧光探针，可特异性对细胞膜成像，经连续激发，荧光性能稳定，并且能够在酸性条件下稳定的成像。本专利技术采取的详细技术方案如下：一种细胞膜成像荧光探针，所述探针为一种含有吡喃糖苷的苝酰亚胺衍生物，其具有如下式（I）所示结构：式（I）。进一步地，所述R基团为正辛基，所述荧光探针的化学名称为：N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺；其具有以下式（II）所示结构：式（II）。所述细胞荧光探针N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺的制备方法，具体步骤如下：将0.5g（0.99mmol）N-辛烷基-3,4:9,10-苝四甲酸-3,4-酐-9,10-亚胺加入到100mL的圆底烧瓶中，依次加入0.35g（4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷，1.09g醋酸锌，15.0g咪唑，氮气保护，于160℃下反应2.5h。反应停止后，冷却至室温，将反应物转移至480mL的乙醇和80mL水混合溶液中，搅拌，静置过夜，抽滤，得到红色固体，将其真空干燥，随后用CH2Cl2和少量DMF洗涤，得N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺。本专利技术所述荧光探针应用于在细胞成像中：所述探针附着于细胞膜表面或进入细胞后分布于细胞膜上，以使细胞膜显像。进一步地，应用于pH6.0-7.4环境下肿瘤细胞膜的成像。所述肿瘤细胞为神经母细胞瘤细胞。利用所述荧光探针的细胞成像方法，具体包括如下步骤：1）分别准备含有所述荧光探针的工作液和预培养细胞，其中所述含有荧光探针的工作液用磷酸盐缓冲溶液配置；2）将含有所述荧光探针的工作液与细胞共同孵育25-35min，与细胞共同孵育时荧光探针的浓度为5-20μM；3）经过激发形成细胞图像、并进行观察，其中激发光的波长为605nm。进一步地，所述肿瘤细胞为神经母细胞瘤细胞。本专利技术有益效果：1）本专利技术使用苝酰亚胺衍生物，即在苝四羧酸二酐的一端引入烷基链，用于和细胞膜脂质双分子层通过疏水作用相结合，另外一端引入吡喃糖基增加该衍生物的水溶性，并赋予化合物双亲性，可在PBS溶液中自组装为纳米颗粒，待细胞内吞后，可在胞质中解聚为单体，重分布于细胞膜表面以及抑制化合物的团聚改善胞膜成像效果。本专利技术所述N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺可特异性对细胞膜成像，经连续激发，荧光性能稳定，连续照射9min可保持初始荧光强度。2）本专利技术中，N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺具有较强的荧光强度，由于化合物自身具有稠环共轭结构，并使之具有良好的耐酸性，因此，在酸性环境下仍可以保持稳定的荧光成像能力。尤其在pH=6的弱酸环境中，本申请所述N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺荧光成像性能稳定，具有良好的耐酸性和光稳定性。附图说明图1为（A）PDI-OBAG在SH-SY5Y细胞的荧光成像与共DiO共定位图和（B）空白试验组；图2为（A）PDI-OBAG细胞荧光成像阳性率与（B）平均荧光图；图3为PDI-OBAG在（A）pH=7.4和（B）pH=6.0时细胞荧光成像图；图4为（A）PDI-OBAG和（B）DiI连续激光照射荧光成像图和（C）相应荧光强度；图5为PDI-OBAG和（A）DiI和（B）DiO生物兼容性对照图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应该理解为对本专利技术请求保护范围的限制。主要试剂：cck-8试剂盒、磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）、DMEM（Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium）、血清均为市售产品；常用培养基和溶液：75%的酒精（75%体积分数的乙醇水溶液）、0.05%胰酶（trypsin-EDTA-D-Hanks，含有体积分数为0.05%胰酶的PBS）、DiO（10μM）；DiI（10μM）；Hoechst33258（10μM）；完全培养基（包括以下体积分数物质：89%的DMEM，10%的血清，1%的双抗）均按照现有技术制备即可，不再详细描述；主要仪器：酶标仪，型号TECAN-Spark，购买自TECAN；激光共聚焦显微本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞膜成像荧光探针，其特征在于，是一种含有吡喃糖苷的苝酰亚胺衍生物，其具有如下式（I）所示结构：

【技术特征摘要】
1.一种细胞膜成像荧光探针，其特征在于，是一种含有吡喃糖苷的苝酰亚胺衍生物，其具有如下式（I）所示结构：式（I）。2.如权利要求1所述细胞膜成像荧光探针，其特征在于，R基团为正辛基，其化学名称为：N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺；其具有以下式（II）所示结构：式（II）。3.如权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将0.5gN-辛烷基-3,4:9,10-苝四甲酸-3,4-酐-9,10-亚胺、0.35g（4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、1.09g醋酸锌、15.0g咪唑混合，于氮气保护、160℃下反应2.5h；反应停止后，冷却并将反应物转移至480mL的乙醇和80mL水混合溶液中，搅拌、静置、抽滤，得到红色固体，将红色固体干燥后用CH2Cl2和DMF洗涤，得到得N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄永伟，刘中华，刘芳，李晓，王俊超，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南,41