一种检测心源性猝死相关SCN5A基因上心源性猝死相关SNP的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测心源性猝死相关SCN5A基因上心源性猝死相关SNP的试剂盒及其检测方法，具体包括以下步骤：一、以样本中提取的DNA为模板，制备Multiplex PCR及其纯化处理；二、SNaPshot单碱基延伸反应(SBE)及其纯化处理；三、SNaPshot单碱基延伸产物的毛细管电泳及其结果分析；四、灵敏度检测。本发明专利技术能一次性检测SCN5A基因上的45个心源性猝死(SCD)相关SNP，并得到清晰的结论。本方法不再利用一代测序和二代测序技术进行全基因组的比对。不需要特殊仪器和方法筛查心源性猝死相关的基因遗传背景。

A Kit for Detecting Sudden Cardiac Death-related SNP in Cardiac Sudden Death-related SCN5A Gene and Its Detection Method

The invention discloses a kit for detecting sudden cardiac death-related SNP on the SCN5A gene associated with sudden cardiac death and a detection method thereof. The kit comprises the following steps: 1. Preparing and purifying Multiplex PCR using the DNA extracted from the sample as the template; 2. SNaPshot single base extension reaction (SBE) and its purification; SNaPshot single base extended products were analyzed by capillary electrophoresis and result analysis; four, sensitivity test. The invention can detect 45 sudden cardiac death (SCD) related SNPs on the SCN5A gene at one time, and has a clear conclusion. This method does not use genome sequencing and two generation sequencing technology for genome wide alignment. There is no need for special instruments and methods to screen the genetic background related to sudden cardiac death.

【技术实现步骤摘要】
一种检测心源性猝死相关SCN5A基因上心源性猝死相关SNP的试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及基因检测及其应用领域，特别涉及到一种心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒。
技术介绍
心源性猝死可见于以下情况：(1)在原有器质性心脏病的基础上(如冠心病和心肌缺血)导致的猝死；(2)隐匿性离子通道类疾病或心肌病导致的猝死；(3)大量运动，情绪激动乃至不明原因的夜间猝死；(4)相关基因遗传性因素的参与等等。随着DNA测序技术和SNP突变检测技术的发展，突变位点的检测能力有了很大的提高，但是还没有专门针对SCD相关基因SCN5A的SNP筛查试剂盒。检测基因突变常用技术可大致分为两种策略：(一)蛋白层次的检测。该层次的检测属于间接的检测，主要借助一些蛋白分析技术，分析突变体产生的变异蛋白，以及由变异蛋白引起的其他性状的改变。(二)遗传物质(DNA)层次的直接检测：包括单链构象异构多态分析技术(SSCP)，Taqman探针法，变性高效液相色谱分析(DHPLC)，测序分析(主要是一代和二代测序)，基因芯片技术等。上述检测方法的不足之处如下：1：单链构象异构多态分析技术(SSCP)：SSCP技术是在检测突变领域中应用较为广泛的一种方法。其基本原理是基于DNA在某一非变性环境中有特定的二级构象，通过电泳迁移率的差异从而分出正常链和异常链。缺点是这种技术的突变检出率只有50％-80％，且不能准确的找到突变的碱基类型和位置。2：Taqman探针法：探针法准确性好，适合于较少SNP的大量样本检测。主要缺点是价格贵，是不能读出序列，不太直观。3：变性高效液相色谱分析(DHPLC)：DHPLC技术代表了突变检测手段的新进展。该技术通过自动化程序式操作即可完成对外显子大小片段的全部检测。缺点就是本法对实验室的要求较高，价格贵，不能普遍应用于广泛的法医实验室。4:一代测序(Sanger测序)分析：一代测序读长较长，准确性高，是法医学分析小样本DNA的主要方法。其主要缺点是(1)测序的成本较高，不能满足一部分法医实验室的需求；(2)通量较低，虽然可以准确分析出基因组的序列，但是不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型，因此对于一些与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。5：二代DNA测序技术：该技术可以通过软件等链接获得每一个检测的片段，从而合成分析的序列。但是该技术有以下缺点(1)仪器和试剂等造成方法昂贵且需要专业人员分析，难以普及；(2)较SNP分析而言，该方法可以得到一条DNA链上的所有信息，多态性大大提高，但有一定的错误率，对于法医学分析而言，尚需要仔细评估。6：基因芯片(DNA芯片)分析，是目前国外较为普遍的分析方法：该方法通过激光共聚焦扫描对杂交荧光信号的有无进行检测分析，从而找出突变。该方法的缺点是技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围狭窄等。
技术实现思路
为了克服现有技术中的缺陷，提供一种检测心源性猝死相关SCN5A基因上心源性猝死相关SNP的试剂盒及其检测方法。本专利技术通过下述方案实现：一种心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒，其中所述SNP选自如下表1所示SNP中两个或两个以上：表1所述试剂盒包含针对上述SNP的位点的特异性多重PCR引物对，该多重PCR引物对通过扩增能够同时得到包含不同SNP的扩增子，每段扩增子至少含有一个SNP，最多含有5个SNP；且所述试剂盒还包含SNP的SNaPshot单碱基延伸引物。其中所述特异性多重PCR引物对选自如下表2中的引物对：表2其中所述SNP的SNaPshot单碱基延伸引物选自如下表3的引物：表3其包含前文中所定义的所有的多重PCR引物和所有的SNaPshot单碱基延伸引物。一种基于心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：一、以样本中提取的DNA为模板，通过选自前文中所定义的引物对制备MultiplexPCR产物并进行纯化处理；二、对MultiplexPCR产物通过选自前文中所定义的单碱基延伸引物进行SNaPshot单碱基延伸反应(SBE)，并进行纯化处理；三、对SNaPshot单碱基延伸产物进行毛细管电泳并进行结果分析。其还包括对检测结果进行灵敏度检测。所述样本包括健康个体构成的对照组、尸检结果为心源性猝死的甲醛固定组织样本作为心源性猝死组、尸检结果为甲醛固定组织样本作为非心源性猝死组；所述样本中提取DNA的步骤为：采用OMEGA全血基因组DNA试剂盒提取人体静脉血DNA，用QIAGEN血液组织DNA提取试剂盒提取甲醛固定组织DNA，将样品中的DNA特异性结合到硅胶膜上，通过两次洗涤将PCR抑制剂完全去除，最后结合在离心柱上的纯核酸可用水或试剂盒中的缓冲液进行洗脱收集，对于提取的DNA按照光密度值法进行定量分析，确定基因组DNA的含量和浓度。本专利技术方法的有益效果为：本专利技术能一次性检测SCN5A基因上的45个心源性猝死(SCD)相关SNP，并得到清晰的结论。本方法不再利用一代测序和二代测序技术进行全基因组的比对。不需要特殊仪器和方法筛查心源性猝死相关的基因遗传背景。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步说明：SNP分析技术有很多种，由于单个SNP的突变类型较多，因此，很少用直接测序或者探针的方法检测突变；对于调查SCN5A相关SNP的突变，目前国外已有相应的试剂盒，用于分析临床上与其相关的遗传性疾病和离子通道型疾病，如心肌病，BugadaSyndrome(Brs),longQTsyndrome(LQTS)等，但未见法医学中对SCD遗传背景和遗传基础的分析。本方法采用的是多重PCR技术和SNaPshot微测序技术相结合的方法来解决位于SCN5A基因上SCD相关的45个SNP的检测问题，其过程如下：首先选取国内外已经报道过的确定在SCN5A基因上与SCD有关联的31个SNP，为了扩大检测试剂盒的适用范围，发现山西人群潜在的特征性的突变位点，在NCBI数据库中又选取了14个位于基因SCN5A上的致病SNP。至此，该检测试剂盒一共涵盖了位于SCN5A基因上45个SCD相关的SNP以检测山西人群与SCD的联系。(1)对含有SNP位点的每一对PCR引物进行单独PCR扩增(共30对引物)，以验证每个扩增产物的特异性。其中每对上下游引物之间最少含有一个待测SNP，最多含有5个待测SNP(见表2)。(2)为了是扩增效率最大化，将30对引物分成两个体系分别进行多重PCR扩增，得到复合扩增产物。(3)对两组复合扩增产物所包含的SNP分别进行检测(体系1st含有22个SNP，体系2nd含有23个SNP)，其原理结合了SNaPshot微测序技术和毛细管电泳(CE)技术检测突变碱基的类型和位置，从而确定样本在SCN5A上45个SNP的分型。本专利技术的技术方案为：一种心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒，其中所述SNP选自如下表1所示SNP中两个或两个以上：表1所述试剂盒包含针对上述SNP的位点的特异性多重PCR引物对，该多重PCR引物对通过扩增能够同时得到包含不同SNP的扩增子，每段扩增子至少含有一个SNP，最多含有5个SNP；且所述试剂盒还包含SNP的SNaPshot单碱基延伸引物。其中所述特异性多重PCR引物对选自如下表2中的引物对：表2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒，其特征在于，其中所述SNP选自如下表所示SNP中两个或两个以上：

【技术特征摘要】
1.一种心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒，其特征在于，其中所述SNP选自如下表所示SNP中两个或两个以上：所述试剂盒包含针对上述SNP的位点的特异性多重PCR引物对，该多重PCR引物对通过扩增能够同时得到包含不同SNP的扩增子，每段扩增子至少含有一个SNP，最多含有5个SNP；且所述试剂盒还包含SNP的SNaPshot单碱基延伸引物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中所述特异性多重PCR引物对选自如下引物对：3.根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于：其中所述SNP的SNaPshot单碱基延伸引物选自如下的引物：4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其包含权利要求2和权利要求3中所定义的所有的多重PCR引物和所有的SNaPshot单碱基延伸引物。5.一种基于心源性猝死相关SCN5A基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：一、以样本中提取的DNA为模板，通过选自上述权利要求2中所定义的引物对制备MultiplexPCR产物并进行纯化处理；二、对Multipl...

【专利技术属性】
技术研发人员：贠克明，张更谦，王佳琦，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西,14