双亲性靶向穿膜肽及其自组装的纳米探针、载药纳米颗粒制造技术

本发明专利技术涉及纳米药物领域，具体公开了双亲性靶向穿膜肽及其自组装的纳米探针、载药纳米颗粒。所述双亲性靶向穿膜肽的序列为：Ac‑RGDDK(C12‑C18)CK(C12‑C18)DR/KGDR/K‑COOH。将本发明专利技术所述双亲性靶向穿膜肽溶解在含有疏水性药物或荧光探针的有机溶剂中，得混合液；将所述混合液分散于水或磷酸缓冲液(PBS)中，超声处理，使所述双亲性靶向穿膜肽在自组装过程中包裹所述疏水性药物或荧光探针形成疏水性核心，即得载药纳米颗粒或纳米探针。本发明专利技术所述的双亲性靶向穿膜肽自组装形成的纳米载体对疏水性药物载药量高，对αv整合素和神经纤毛蛋白‑1(NRP‑1)阳性肿瘤具有高亲和力和穿膜功效，极大提高了肿瘤靶向和药物递送效率。

Amphiphilic targeting transmembrane peptides and their self-assembled nanoprobes and drug loaded nanoparticles

The invention relates to the field of nanomedicine, in particular to amphiphilic targeted transmembrane peptides, self-assembled nanoprobes and drug-loaded nanoparticles. The sequences of amphiphilic targeting peptides are: Ac RGDDK (C12 C18) CK (C12 C18 C18) DR/KGDR/K COOH. The amphiphilic targeted transmembrane peptide is dissolved in an organic solvent containing a hydrophobic drug or a fluorescent probe to obtain a mixed solution; the mixed solution is dispersed in water or a phosphoric acid buffer (PBS) and processed by ultrasound to form the amphiphilic targeted transmembrane peptide encapsulating the hydrophobic drug or a fluorescent probe in the self-assembly process. Hydrophobic core, that is, drug nanoparticles or nanoprobes. The nanocarrier formed by the self-assembly of the amphiphilic targeted penetrating membrane peptide has high drug loading capacity for hydrophobic drugs, high affinity and penetrating efficiency for alpha v integrin and neurocilia protein_1 (NRP_1) positive tumors, and greatly improves tumor targeting and drug delivery efficiency.

【技术实现步骤摘要】
双亲性靶向穿膜肽及其自组装的纳米探针、载药纳米颗粒
本专利技术涉及纳米药物领域，具体地说，涉及双亲性靶向穿膜肽及其自组装的纳米探针、载药纳米颗粒与应用。
技术介绍
纳米级药物载体是一种纳米级的药物输送系统，通过设计具有特定功能的药物载体，可以制备出生物相容性好、结构稳定、功能多样的纳米载药体系。近年来用于肿瘤靶向和药物递送的自组装纳米系统由于其在肿瘤诊断和治疗中的巨大潜力而被广泛研究。然而，把药物高效特异地递送至肿瘤组织仍面临许多困难。这可以归因于肿瘤组织中的血管壁和细胞膜屏障，此外，肿瘤的异质性和致密的基质也会阻止这些纳米颗粒深入转运到肿瘤组织。为了克服这些障碍，需要精心设计同时具有靶向和穿膜功效的新型纳米体系。多肽由于其良好的生物相容性和较低的合成成本而被广泛用于靶向肿瘤，基于多肽的纳米系统由于其良好的生物相容性，稳定性和高靶向效率而被广泛研究。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术首先提供了一种含有RGD和R/KGDR/K基序的双亲性靶向穿膜肽。其序列为：Ac-RGDDK(C12-C18)CK(C12-C18)DR/KGDR/K-COOH；该序列的RGD部分被设计为与细胞表面的αv整合素特异性地相互作用，R/KGDR/K基序被设计为与细胞膜上的神经纤毛蛋白-1(NRP-1)受体相互作用以介导细胞内吞作用。额外的两个天冬氨酸(D)被加入以增加亲水头部的电负性和亲水性。在特异性靶向αv整合素和神经纤毛蛋白-1受体的靶向穿膜肽的赖氨酸侧链偶联疏水性功能分子，得到双亲性靶向穿膜肽。所述序列中：R为精氨酸，G为甘氨酸，D为天冬氨酸，K为赖氨酸，C为半胱氨酸，R/K为精氨酸或赖氨酸，Ac为乙酰基，-COOH为裸露羧基端，(C12-C18)为赖氨酸侧链偶联的疏水性功能分子，所述疏水性功能分子为C12-C18的直链脂肪酸或胆固醇。即，所述双亲性靶向穿膜肽为下列(1)-(4)之一：(1)Ac-RGDDK(C12-C18)CK(C12-C18)DRGDR-COOH；(2)Ac-RGDDK(C12-C18)CK(C12-C18)DRGDK-COOH；(3)Ac-RGDDK(C12-C18)CK(C12-C18)DKGDR-COOH；(4)Ac-RGDDK(C12-C18)CK(C12-C18)DKGDK-COOH。作为优选，所述双亲性靶向穿膜肽的序列为：Ac-RGDDK(C12-C18)CK(C12-C18)DRGDK-COOH。其结构式为：所述双亲性靶向穿膜肽是采用本领域常用的Fmoc固相合成法制备得到，本专利技术对此不另做限定。上述优选的双亲性靶向穿膜肽的亲水性部分为：Ac-RGDDKCKDRGDK-COOH，除了靶向功能的序列外，添加了两个天冬氨酸以增加亲水性和自组装后纳米载体的电负性；疏水性部分为C12-18的直链脂肪酸或胆固醇。与胆固醇等疏水性功能分子相比，直链脂肪酸更容易与多肽反应，所得的双亲性靶向穿膜肽更稳定，且直链脂肪酸无其他侧链基团，更有利于后期的自组装。因此，作为优选，所述疏水性功能分子可采用十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸；最优选为C18直链脂肪酸。所述疏水性功能分子采用化学方法偶联到前述对应的两个赖氨酸的侧链上，即得双亲性靶向穿膜肽。本专利技术进一步提供一种纳米载体，由所述双亲性靶向穿膜肽通过自组装而成，所述纳米载体为球形结构，其粒径为25-60nm。其中，所述自组装在超声条件下完成，超声频率30-50kHz(优选40-50kHz)，超声功率50-100W，超声时间5-15min。在此基础上，本专利技术进一步提供一种纳米颗粒或纳米探针，由所述纳米载体包裹目标分子而成。其中，所述目标分子包括疏水性药物或荧光探针。所述疏水性药物优选为阿霉素。更为具体地，本专利技术以目标分子为疏水性药物或荧光探针为例，提供上述纳米颗粒或纳米探针的制备方法：将本专利技术所述双亲性靶向穿膜肽溶解在含有疏水性药物或荧光探针的有机溶剂中，得混合液；将所述混合液分散于水或磷酸缓冲液(PBS)中，超声处理，使所述双亲性靶向穿膜肽在自组装过程中包裹所述疏水性药物或荧光探针形成疏水性核心，即得；所述超声处理的频率为30-50kHz(优选40-50kHz)，功率为50-100W，超声时间为5-15min。本专利技术所述的纳米颗粒以αv整合素和神经纤毛蛋白-1受体为靶点，自组装的纳米载体能通过RGD序列特异性与αv整合素结合，同时通过暴露在羧基端的RGDK基序与神经纤毛蛋白-1(NRP-1)受体相互作用，介导自组装纳米载体穿膜进入细胞。对于许多肿瘤细胞系，αv整合素和NRP-1受体是过表达的，因此可以作为肿瘤靶向穿膜药物递送的靶标。所述有机溶剂选自二甲基亚砜、二氯甲烷或甲醇。其中，本专利技术最优选的溶剂为二甲基亚砜。以二甲基亚砜溶解所述双亲性靶向穿膜肽，双亲性靶向穿膜肽可顺利自组装包载疏水药物或荧光探针，药物的包封率高，且得到的自组装纳米颗粒稳定性好，粒径均一，且具有良好的生物相容性。所述疏水性药物或荧光探针与所述双亲性靶向穿膜肽的摩尔比为1：(5-15)。所述水或磷酸缓冲液的用量体积，为所述有机溶剂用量体积的100-200倍。优选地，所述制备方法还包括在超声结束后，室温静置1-2h，采用超滤管超滤去除未包载的疏水性药物及荧光探针。其中，所用超滤管的截留分子量为30kD。本专利技术所提供的双亲性靶向穿膜肽对疏水性药物和疏水性荧光探针都具有非常好的包封率。其中，所述双亲性靶向穿膜肽可同时包载一种或几种的疏水性药物和荧光探针，具体可依据实际需要而定。研究发现，当所述双亲性靶向穿膜肽赖氨酸侧链偶联有C18直链脂肪酸时，自组装对于广谱疏水性化疗药物阿霉素的包封率很高，得到的载药纳米颗粒可用于乳腺癌等的靶向治疗。进一步地，本专利技术还提供了所述纳米颗粒或纳米探针在制备肿瘤诊断试剂或肿瘤靶向治疗药物中的应用。所述肿瘤包括但不限于αv整合素和神经纤毛蛋白-1(NRP-1)阳性肿瘤。本专利技术利用靶向穿膜肽和疏水性功能分子偶联得到两亲性多肽，通过自组装方式包载疏水性抗肿瘤药物和荧光探针以形成纳米颗粒和纳米探针，这种纳米颗粒或荧光纳米探针可以通过两个步骤富集于肿瘤部位：RGD基序特异性结合肿瘤血管内皮细胞上的αv整合素，然后R/KGDR/K基序与神经纤毛蛋白-1(NRP-1)受体特异性相互作用，介导纳米颗粒内吞进入细胞和组织，从而实现肿瘤的特异性诊断和治疗。本专利技术的双亲性靶向穿膜肽自组装形成高度有序的纳米结构，自组装过程中不产生共价键，没有逆反应，用于肿瘤的诊断和治疗具有生物相容性好、无生物毒性等优势。本专利技术设计的基于靶向穿膜肽自组装形成的多功能纳米载体对疏水性药物载药量高，对αv整合素和神经纤毛蛋白-1(NRP-1)阳性肿瘤具有高亲和力和穿膜功效，极大提高了肿瘤靶向和药物递送效率。自组装得到的纳米载体粒度分布均一，稳定性高，生物相容性好，生物安全性高。本专利技术的制备方法简单，制备的纳米颗粒可作为纳米探针用于肿瘤诊断和纳米载体用于靶向肿瘤穿膜性药物递送，在肿瘤诊断及抗肿瘤纳米药物领域具有巨大的应用潜力。附图说明图1是实施例1制备得到的载药纳米颗粒在水溶液中的形貌图；图2是实施例1制备得到的载药纳米颗粒的粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双亲性靶向穿膜肽，其特征在于，其序列为：Ac‑RGDDK(C12‑C18)CK(C12‑C18)DR/KGDR/K‑COOH；其中：R为精氨酸，G为甘氨酸，D为天冬氨酸，K为赖氨酸，C为半胱氨酸，R/K为精氨酸或赖氨酸，Ac为乙酰基，‑COOH为裸露羧基端，(C12‑C18)为赖氨酸侧链偶联的疏水性功能分子，所述疏水性功能分子为C12‑C18的直链脂肪酸或胆固醇。

【技术特征摘要】
1.一种双亲性靶向穿膜肽，其特征在于，其序列为：Ac-RGDDK(C12-C18)CK(C12-C18)DR/KGDR/K-COOH；其中：R为精氨酸，G为甘氨酸，D为天冬氨酸，K为赖氨酸，C为半胱氨酸，R/K为精氨酸或赖氨酸，Ac为乙酰基，-COOH为裸露羧基端，(C12-C18)为赖氨酸侧链偶联的疏水性功能分子，所述疏水性功能分子为C12-C18的直链脂肪酸或胆固醇。2.根据权利要求1所述的双亲性靶向穿膜肽，其特征在于，所述疏水性功能分子为C18的直链脂肪酸。3.一种纳米载体，其特征在于，由权利要求1或2所述的双亲性靶向穿膜肽通过自组装而成，所述纳米载体为球形结构，其粒径为25-60nm。4.一种纳米颗粒或纳米探针，其特征在于，由权利要求3所述的纳米载体包裹目标分子而成。5.根据权利要求4所述的纳米颗粒或纳米探针，其特征在于，所述目标分子包括疏水性药物或荧光探针；优选所述疏水性药物为阿霉素。6.根据权利要求5所述的纳米颗粒或纳米探针，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：向治楚，方巧君，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京,11