凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN及其重组蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv‑BigPEN及其重组蛋白和应用。所述Lv‑BigPEN为凡纳滨对虾Penaeidin（PEN）抗菌肽家族基因，其核酸序列长810 bp，开放阅读框编码269个氨基酸，推测蛋白分子量为29.2 kDa。本发明专利技术利用表达载体Pet32a(+)和表达菌株大肠杆菌Transetta（DE3）进行原核重组表达，获得了具有生物活性的重组蛋白，所述重组蛋白具有广谱的抗微生物活性，能够对多种细菌和WSSV病毒产生抑制作用。该重组蛋白可以用于生产畜禽及水产类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂，具有较大的应用前景。

Antibacterial peptide gene Lv-BigPEN of Litopenaeus vannamei and its recombinant protein and Application

The invention discloses antibacterial peptide gene Lv BigPEN of Litopenaeus vannamei and its recombinant protein and application. The Lv_BigPEN is a family of Penaeidin (PEN) antimicrobial peptides gene of Penaeidin vannamei. Its nucleic acid sequence is 810 BP long and the open reading frame encodes 269 amino acids. The molecular weight of the protein is presumed to be 29.2 kDa. The recombinant protein with biological activity is obtained by prokaryotic recombinant expression of the expression vector Pet32a (+) and the expression strain E. coli Transetta (DE3). The recombinant protein has broad-spectrum antimicrobial activity and can inhibit a variety of bacteria and WSSV viruses. The recombinant protein can be used to produce antibiotics, vaccines or feed additives for livestock, poultry and aquatic products, and has a broad application prospect.

【技术实现步骤摘要】
凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN及其重组蛋白和应用
本专利技术属于生物
，更具体地，涉及一种凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN及其重组蛋白和应用。
技术介绍
凡纳滨对虾作为我国主要的对虾养殖品种，具有很高的经济价值。近年来由于养殖环境恶化及养殖密度过大，导致疾病频发，已经严重威胁到了南美白对虾产业的健康发展，造成了巨大的经济损失，因此，开展对虾疾病防控显得尤为重要。凡纳滨对虾的病害呈现多样化，其中以白斑综合症（WSS）、肠孢虫病（EPH）,急性肝胰腺坏死综合征（APHNS）这三种最为严重。近年来，抗生素在水产养殖上的滥用，虽然对病害控制起到了一定的作用，却造成了水体环境恶化、微生物赖药性增加变异出致病性更强、危害更大的治病微生物等问题，使得开发能替代抗生素的抗菌肽变得尤为迫切。抗菌肽（antimicrobialpeptides,AMPs）为一类小分子肽类活性物质，是先天免疫的重要效应分子，直接参与杀死和清除感染的病原微生物，在先天免疫中起到了重要作用。同时，与传统的抗生素相比抗菌肽作为多肽抗生素具有针对性强、无污染、不易产生耐药性等问题。此外，抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温，规模化发酵生产抗菌肽时经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不会导致抗菌肽活性失活，在抗病饲料添加剂研发方面具有重要的应用前景，对抗菌肽的研究是目前学术研究活跃的领域之一。对虾中三类有代表性的抗菌肽为：Penaeidin家族、Crustin家族和抗脂多糖因子（anti-LPSfactor,ALF）家族，它们对于革兰氏菌、病毒和许多原生动物有广泛的抗菌活性。Penaeidin家族氨基酸末端富含半胱氨酸和脯氨酸，能够直接杀死病原，在先天免疫中起着至关重要的作用。在生产上使用化学方法合成小肽的成本高、产量低，但是利用生物工程的手段，通过工程菌株，则能够规模化生产具有活性的抗菌肽。在凡纳滨对虾或者其他甲壳类动物，已经有许多抗菌肽基因被研究报导，但是本专利技术在研究过程中发现了新型的PEN家族的抗菌肽，目前还尚没有关于其核酸序列、重组蛋白的研究以及应用的相关报道。
技术实现思路
本专利技术本专利技术的主要目的在于提供一种凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN基因及其重组蛋白的制备和应用，以解决当前水产养殖病害严重、抗生素滥用引起的生态破坏和水产食品药物残留等问题。本专利技术的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN基因。本专利技术的第二个目的是提供一种凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN。本专利技术的第三个目的是提供所述凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN基因的应用。本专利技术的第四个目的是提供所述凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN基因重组蛋白的制备方法。本专利技术的第五个目的是提供所述纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN基因重组蛋白的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。Lv-BigPEN基因编码的凡纳滨对虾抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术首次发现并命名了凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN，其核酸序列长810bp，开放阅读框编码269个氨基酸，推测蛋白分子量为29.2kDa，与对虾Penaeidin家族抗菌肽基因序列具有较高的相似性，均含有保守的PEN结构域，且该抗菌肽含有269个氨基酸，不同于一般的抗菌肽，为一种新型的PEN家族的抗菌肽，具有一定的抗菌活性和较强的抗WSSV活性。因此，本专利技术还保护所述凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN和/或Lv-BigPEN基因编码的凡纳滨对虾抗菌肽在制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。本专利技术请求保护所述凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN在制备凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白中的应用。一种含有上述SEQIDNO：1所示凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN的重组表达载体。优选地，所述重组表达载体为原核表达载体。更优选地，所述原核表达载体为pET32a(+)；具体为将SEQIDNO：1所示凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN连接到原核表达载体pET32a(+)的EcoRI位点和XhoI位点之间，获得重组载体pET32a(+)-Lv-BigPEN。一种含有上述任一所述表达载体的宿主菌。优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。更优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株Transetta（DE3）。上述任一重组表达载体和/或任一宿主菌在制备凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白中的应用也在本专利技术保护范围内。一种凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白的制备方法，将SEQIDNO：1所示凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN连接到表达载体上，获得重组载体；将构建好的重组载体转化到宿主菌中间进行表达，阳性克隆，并进行诱导表达，收集表达上清，再纯化蛋白，得到凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白。优选地，所述表达载体为原核表达载体。更优选地，所述原核表达载体为pET32a(+)；具体为将SEQIDNO：1所示凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN连接到原核表达载体pET32a(+)的EcoRI位点和XhoI位点之间，获得重组载体pET32a(+)-Lv-BigPEN。优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。更优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株Transetta（DE3）。优选地，所述诱导表达为用IPTG进行诱导表达；IPTG终浓度为0.1mM~0.5mM。优选地，所述纯化蛋白为用Ni-NTA基质进行纯化。本专利技术还请求保护上述制备方法制备得到的凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白。所述的抗菌肽Lv-BigPEN对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌等多种细菌的生长均有抑制作用；将所述的抗菌肽抗菌肽Lv-BigPEN与WSSV病毒孵育后，能显著降低WSSV病毒的感染活性。所述革兰氏阴性菌为副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus），嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila），铜绿假单胞杆菌（Pseudomonasaeruginosa），大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）；革兰氏阳性菌为粪链球菌（Enterococcusfaecalis），金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），黄色微球菌（Micrococcusluteus）同时，所述凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白在制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用亦在本专利技术保护范围内。具体地，所述抗菌药物为鱼类和虾类抗菌药物。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次发现并命名了凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN，所述Lv-BigPEN基因为凡纳滨对虾Penaeidin（PEN）抗菌肽家族，其核酸序列长810bp，开放阅读框编码269个氨基酸，推测蛋白分子量为29.2kDa。通过利用表达载体Pet32a(+)和表达菌株大肠杆菌Transetta（DE3）进行原核重组表达，获得了具有生物活性的重组蛋白。并在体外验证了其生物学功能，鉴定该重组蛋白具有广谱的抗微生物活性，能够对多种细菌和WSSV病毒产生抑制作用。该重组蛋白可以用于生产畜禽及水产类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂，具有较大的应用前景。附图说明图1为本专利技术经多重序列比对Lv-BigPEN基因的PEN结构域与Lv-PEN2，Lv-PEN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凡纳滨对虾抗菌肽基因 Lv‑BigPEN，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种含有权利要求1所述基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET32a(+)。5.一种含有权利要求3或4所述表达载体的宿主菌。6.根据权利要求5所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。7.权利要求1所述凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN在制备凡纳滨对虾抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：李朝政，肖邦，何建国，翁少萍，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44