一种植物器官高活性线粒体的快速提取方法及其专用提取液技术

本发明专利技术公开了一种植物器官高活性线粒体的快速提取方法及其专用提取液。该方法包括如下步骤：将植物器官、提取液和研磨介质混合，匀浆，收集滤液并差速离心分离植物器官的线粒体，然后采用线粒体呼吸缓冲液保存。提取液中含有蔗糖、焦磷酸钠、EDTA、磷酸二氢钾、BSA、半胱氨酸、抗坏血酸和pvp‑40。实验证明，本发明专利技术提供的方法具有如下优点：高效，即线粒体活性高；适用性广，可适用于多种被子植物花部器官线粒体的提取；保存时间长，在冰盒上可保持活性5h，可满足大量关于线粒体能量代谢和呼吸的研究；操作简单耗时短。本发明专利技术提供的方法为线粒体呼吸链及能量代谢的研究奠定坚实基础，具有重要的实际应用价值。

A rapid extraction method for highly active mitochondria from plant organs and its special extraction solution

The invention discloses a rapid extraction method for highly active mitochondria from plant organs and a special extraction solution thereof. The method includes the following steps: mixing plant organs, extracting liquid and grinding medium, homogenizing, collecting filtrate and separating mitochondria from plant organs by differential speed centrifugation, and then using mitochondrial respiratory buffer solution. The extract contains sucrose, sodium pyrophosphate, EDTA, potassium dihydrogen phosphate, BSA, cysteine, ascorbic acid and PvP 40. The experiment proved that the method provided by the invention has the following advantages: high efficiency, high mitochondrial activity, wide application, suitable for the extraction of mitochondria of various angiosperms, keeping a long storage time and keeping active 5h on ice box, which can satisfy a large number of studies on mitochondrial energy metabolism and respiration; operation is simple. Short time. The method provided by the invention lays a solid foundation for the study of mitochondrial respiratory chain and energy metabolism, and has important practical application value.

【技术实现步骤摘要】
一种植物器官高活性线粒体的快速提取方法及其专用提取液
本专利技术属于生物
，具体涉及一种植物器官高活性线粒体的快速提取方法及其专用提取液。
技术介绍
花作为被子植物的重要特征之一，由萼片、花瓣、雄蕊(雄蕊群)和雌蕊(雌蕊群)组成，其与植物的生殖过程密切相关，是保证被子植物传粉、受精及顺利结实的重要生殖器官。因此，花部器官作为植物生殖生物学研究的重点对象而备受关注。并且，由于花器官作为植物生殖繁育的重要场所，生命活动旺盛，而线粒体作为能量代谢的重要细胞器，能够进行氧化磷酸化和电子传递等生理活动以响应不同的细胞事件，在植物生殖发育中起着能量供应的重要作用，因此花亦是研究线粒体呼吸和能量代谢的重要组织器官。目前，提取高活性线粒体用于呼吸，能量代谢及超氧化物水平的研究体系多见在动物研究中的报道，以在心肌细胞和骨骼肌细胞中提取技术较为成熟；然而在植物中，提取线粒体的研究对象主要集中在模式植物拟南芥、水稻及其单细胞的花粉管等，且提取方法过于冗繁。目前研究中大多数植物种类为非模式植物，且研究对象多为植物生理状态活跃的组织和器官，迄今为止，尚无针对非模式植物，特别是针对具重要生殖功能的花部器官进行快速提取高活性线粒体的技术方法，从而导致对植物生殖发育中的花部器官线粒体呼吸乃至植物能量代谢的研究相对滞后，因此，高效活性植物线粒体的提取技术需求迫切且至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提取植物器官的线粒体的方法。本专利技术所提供的植物器官线粒体的提取方法，可包括步骤(X1)：采用提取液提取植物器官中的线粒体；所述提取液中可含有蔗糖、焦磷酸钠、EDTA、磷酸二氢钾、BSA、半胱氨酸、抗坏血酸和式(Ⅰ)所示的聚合物；n为30～50之间的自然数；式(Ⅰ)所示的聚合物即为聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)。所述提取液中可含有0.27-0.33M蔗糖、22.5-27.5mM焦磷酸钠、1.8-2.2mMEDTA、9-11mM磷酸二氢钾、9-11mg/mLBSA、3.6-4.4mM半胱氨酸、18-22mM抗坏血酸和9-11mg/mL式(Ⅰ)所示的聚合物。所述提取液可为含有0.27-0.33M蔗糖、22.5-27.5mM焦磷酸钠、1.8-2.2mMEDTA、9-11mM磷酸二氢钾、9-11mg/mLBSA、3.6-4.4mM半胱氨酸、18-22mM抗坏血酸和9-11mg/mL式(Ⅰ)所示的聚合物的水溶液。所述提取液的pH值可为7.3-7.8(如7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8)。所述提取液具体可为含有0.3M蔗糖、25mM焦磷酸钠、2mMEDTA、10mM磷酸二氢钾、10mg/mLBSA、4mM半胱氨酸、20mM抗坏血酸和10mg/mL式(Ⅰ)所示的聚合物的水溶液，pH值具体可为7.5。上述提取方法中，所述“采用提取液提取植物器官中的线粒体”的方式可为a1)或a2)：a1)将植物器官和所述提取液混合，匀浆，收集滤液并差速离心分离植物器官的线粒体；a2)将植物器官、所述提取液和研磨介质混合，匀浆，收集滤液并差速离心分离植物器官的线粒体。所述a1)或所述a2)中，植物器官和所述提取液的配比可为1g：1-2mL。上述任一所述提取液中可含有蔗糖、焦磷酸钠、EDTA、磷酸二氢钾、BSA、半胱氨酸、抗坏血酸和式(Ⅱ)所示的聚合物；式(Ⅱ)所示的聚合物即为PVP-40。所述提取液中可含有0.27-0.33M蔗糖、22.5-27.5mM焦磷酸钠、1.8-2.2mMEDTA、9-11mM磷酸二氢钾、9-11mg/mLBSA、3.6-4.4mM半胱氨酸、18-22mM抗坏血酸和9-11mg/mL式(Ⅱ)所示的聚合物。所述提取液可为含有0.27-0.33M蔗糖、22.5-27.5mM焦磷酸钠、1.8-2.2mMEDTA、9-11mM磷酸二氢钾、9-11mg/mLBSA、3.6-4.4mM半胱氨酸、18-22mM抗坏血酸和9-11mg/mL式(Ⅱ)所示的聚合物的水溶液。所述提取液的pH值可为7.3-7.8(如7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8)。所述提取液具体可为含有0.3M蔗糖、25mM焦磷酸钠、2mMEDTA、10mM磷酸二氢钾、10mg/mLBSA、4mM半胱氨酸、20mM抗坏血酸和10mg/mL式(Ⅱ)所示的聚合物的水溶液，pH值具体可为7.5。上述任一所述的提取方法还可包括步骤(X2)：将步骤(X1)提取的植物器官的线粒体和重悬缓冲液混合，差速离心再次分离植物器官的线粒体；所述重悬缓冲液中可含有蔗糖、TESNa(中文名称为N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸单钠盐)和BSA。所述重悬缓冲液中可含有0.27-0.33M蔗糖、9-11mMTESNa和0.9-1.1mg/mLBSA。所述重悬缓冲液可为含有0.27-0.33M蔗糖、9-11mMTESNa和0.9-1.1mg/mLBSA的水溶液。所述重悬缓冲液的pH值可为7.3-7.8(如7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8)。所述重悬缓冲液具体可为含有0.3M蔗糖、10mMTESNa和1mg/mLBSA的水溶液，pH值具体可为7.5。上述任一所述的提取方法还可包括步骤(X3)：采用线粒体呼吸缓冲液保存步骤(X1)或步骤(X2)获得的植物器官的线粒体；所述线粒体呼吸缓冲液中可含有蔗糖、TESNa、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁和BSA。所述线粒体呼吸缓冲液中可含有0.27-0.33M蔗糖、9-11mMTESNa、9-11mM氯化钠、4.5-5.5mM磷酸二氢钾、1.8-2.2mM硫酸镁和0.9-1.1mg/mLBSA。所述线粒体呼吸缓冲液可为含有0.27-0.33M蔗糖、9-11mMTESNa、9-11mM氯化钠、4.5-5.5mM磷酸二氢钾、1.8-2.2mM硫酸镁和0.9-1.1mg/mLBSA的水溶液。所述线粒体呼吸缓冲液的pH值可为7.0-7.5(如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)。所述线粒体呼吸缓冲液具体可为含有0.3M蔗糖、10mMTESNa、10mM氯化钠、5mM磷酸二氢钾、2mM硫酸镁和1mg/mLBSA的水溶液，pH值具体可为7.2。上述提取方法中，所述保存的参数可为：4℃以下保存5h以下(如0℃保存5h、4℃保存3h)。其中，对于不含叶绿体或叶绿体含量较少植物样品(如本专利技术实施例中的荷花花托、荷花花被片)，可按照步骤(X1)和(X3)进行提取。对于叶绿体含量较多的植物样品(如本专利技术实施例中的白玉兰花柱)，可依次按照步骤(X1)、(X2)和(X3)进行提取。本专利技术还保护上述任一所述提取液和/或上述任一线粒体呼吸缓冲液和/或上述任一重悬缓冲液。上述任一所述提取液和/或上述任一线粒体呼吸缓冲液和/或上述任一重悬缓冲液在提取植物器官线粒体中的应用也属于本专利技术的保护范围。上文中，所述植物器官可为b1)至b14)中的任一种：b1)被子植物器官；b2)被子植物花部器官；b3)荷花花部器官；b4)白玉兰花部器官；b5)荷花花被片；b6)荷花雌蕊；b7)荷花花托；b8)荷花花柱；b9)荷花柱头；b10)白玉兰花被片；b11)白玉兰雌蕊；b12)白玉兰花托；b13)白玉兰花柱；b14)白玉兰柱头。本专利技术专利由国本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物器官线粒体的提取方法，包括步骤(X1)：采用提取液提取植物器官中的线粒体；所述提取液中含有蔗糖、焦磷酸钠、EDTA、磷酸二氢钾、BSA、半胱氨酸、抗坏血酸和式(Ⅰ)所示的聚合物；n为30～50之间的自然数；

【技术特征摘要】
1.一种植物器官线粒体的提取方法，包括步骤(X1)：采用提取液提取植物器官中的线粒体；所述提取液中含有蔗糖、焦磷酸钠、EDTA、磷酸二氢钾、BSA、半胱氨酸、抗坏血酸和式(Ⅰ)所示的聚合物；n为30～50之间的自然数；2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述“采用提取液提取植物器官中的线粒体”的方式为a1)或a2)：a1)将植物器官和所述提取液混合，匀浆，收集滤液并差速离心分离植物器官的线粒体；a2)将植物器官、所述提取液和研磨介质混合，匀浆，收集滤液并差速离心分离植物器官的线粒体。3.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：所述a1)或所述a2)中，植物器官和所述提取液的配比为1g：1-2mL。4.如权利要求1至3任一所述的提取方法，其特征在于：所述提取液中含有蔗糖、焦磷酸钠、EDTA、磷酸二氢钾、BSA、半胱氨酸、抗坏血酸和式(Ⅱ)所示的聚合物；5.如权利要求1至4任一所述的提取方法，其特征在于：所述提取方法还包括步骤(X2)：将步骤(X1)提取的植物器官的线粒体和重悬缓冲液混合，差速离心再次分离植物器官的线粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：王若涵，张出兰，刘丽娅，李静，王众司，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11