一种提高罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜甙Ⅴ含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜甙Ⅴ含量的方法。所述方法通过在罗汉果悬浮细胞培养周期的第5～11天，分别添加10～200mg/L的酵母诱导物以及50～260mg/L的茉莉酸甲酯，从而提高罗汉果甜甙Ⅴ的合成速率以及产量，同时降低罗汉果皂甙Ⅱ的分泌量。所述方法有利于罗汉果甜甙Ⅴ的市场化大规模生产以及质量控制管理。

A method for improving the content of Momordica grosvenorin V in suspension cells of Momordica grosvenveni

The invention relates to a method for improving the content of momordicoside V in the suspension cells of Momordica grosvenveni. This method added 10 ~ 200mg/L of yeast inducers and 50 ~ 260mg/L of methyl jasmonate by adding 10 ~ 200mg/L of yeast inducer and 50 ~ 260mg/L methyl jasmonate, respectively, in the fifth ~ 11 days of the culture cycle of grosvena suspension cells, thus improving the synthesis rate and yield of grosvenin V, and reducing the secretion of grosvenin II. The method is conducive to large scale production and quality control management of Momordica grosvenosi v.

【技术实现步骤摘要】
一种提高罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜甙Ⅴ含量的方法
本专利技术涉及生物
，特别是一种提高罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜甙Ⅴ含量的方法。
技术介绍
罗汉果甜甙Ⅴ，又称罗汉果甜苷，是葫芦科罗汉果属罗汉果(Siraitiagrosvenori)的主要甜味成分，其甜度是蔗糖的350倍，目前已鉴定出七种单体成分，其中以罗汉果甜甙Ⅴ及赛门苷Ⅰ的甜度最强。罗汉果甜甙Ⅴ具有清热润肺，利咽开音，润肠通便等药用功效；同时，罗汉果甜甙Ⅴ还具有味道新颖、口味纯正等特点，从而使其深受人们的喜爱，是肥胖症、高血压、糖尿病患者等特殊人群最适宜的甜味剂和保健品，具有广泛的应用价值。目前，获取罗汉果甜甙Ⅴ的方法主要是以天然罗汉果为原料，并通过加热等方法提取制备而成。但是，天然罗汉果中的固有罗汉果甜甙Ⅴ成分极低，现有技术对于罗汉果的利用率以及罗汉果甜甙Ⅴ的提取率并不高，造成了极大的原料浪费，同时也不能满足日益增长的市场需求。通过植物细胞培养技术生产目的次级代谢产物，是提高天然植物中目标成分含量的有效手段之一。细胞悬浮培养具有繁殖速度快、培养规模大和提供大量均匀一致植物细胞培养物的特点。因此，通过植物细胞培养技术培养生产罗汉果甜甙Ⅴ，能有效提高罗汉果甜甙Ⅴ的含量和降低生产成本，有利于罗汉果甜甙Ⅴ的进一步市场化。如对比文件1公开号为CN102174463B的中国专利文本中公开了“一种罗汉果愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法”，培养得到罗汉果总苷、罗汉果甜甙Ⅴ分别占细胞重量8.11％、5.77％的罗汉果悬浮细胞。但该方法的培养周期长达21d，增加了操作维护的难度及成本，且所得含量还远远不能满足罗汉果甜甙Ⅴ市场化的需求。在植物次生代谢过程中，诱导物作为一种特殊的生化分子能够快速、专一并有选择地诱导某些特定基因的表达，从而提高代谢途径中相关酶的活性，进而促进或抑制受该酶调控的次生产物的产量。真菌诱导物是来源于微生物分子的一种确定的化学信号，能够刺激植物细胞，使其快速地发生防御应答反应，从而高度专一并选择性地激活植物特定基因的表达，进而活化特定的次生代谢途径，促进次生代谢产物的合成。如对比文件2《罗汉果细胞培养体系的建立及甜甙v形成的调控》(陈兰桂，广西师范大学，2010)的中国文献记载了加入总糖浓度为300mg/L的黑曲霉粗提物中的组分(蛋白质+多糖)可使罗汉果甜甙Ⅴ的总量比对照组提高246.72％；添加500mg/L苯丙氨酸可以明显促进细胞合成罗汉果甜甙Ⅴ，罗汉果甜甙Ⅴ的总量比对照组提高了260.38％。该方法虽然提高了罗汉果甜甙Ⅴ的含量，但也同时增加了苦涩味成分的分泌合成，增加了后续制备流程中对罗汉果甜甙Ⅴ分离纯化的难度及成本。酵母(Yeast)是植物细胞培养中普遍使用的诱导物，能诱导或促进次级代谢产物的形成。研究表明，在Ti转换丹参(Salviamiltiorrhiza)细胞培养中,酵母诱导物的添加使隐丹参醌(Cryptotanshinone)获得两倍增长。而酵母也使蓝雪花(Plumbagoroseal)培养中蓝雪醌(Plumbagin)的含量提高了3倍。但不同体系其诱导作用有所不同。茉莉酸甲酯(MethylJasmonate,MeJA)是激发次生代谢物积累的非生物类诱导因子，不同植物悬浮培养体系中加入茉莉酸甲酯后能够诱导细胞中次生代谢物积累增加。以200μmol/L茉莉酸甲酯处理怀槐(MaackiaamurensisRupr.etMaxim)悬浮培养细胞9d后，异黄酮含量增加为同期对照的417.18％；以100μmol/L茉莉酸甲酯处理南方红豆杉(Taxuschinensis)悬浮细胞时，其紫杉醇含量提高了10倍。然而，茉莉酸甲酯加入一些植物悬浮培养体系后也容易诱导悬浮细胞发生过敏反应或促使酚类化合物释放，从而导致悬浮细胞褐化。以1.0mg/L茉莉酸甲酯处理野葛悬浮细胞时，其细胞培养物中葛根素的含量虽有提高，但细胞明显褐化。目前尚无以酵母或茉莉酸甲酯处理罗汉果悬浮细胞培养体系的报告。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种提高罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜甙Ⅴ含量的方法。所述方法不仅缩短了罗汉果悬浮细胞的生产培养周期，降低了生产过程中的操作维护成本，还有效提高了罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜甙Ⅴ的含量，同时降低了苦涩味成分的合成分泌。本专利技术专利技术人发现，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中，通过加入适量的酵母诱导物及茉莉酸甲酯，能有效提高罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜甙Ⅴ的含量以及加快其合成速率，同时降低罗汉果皂甙Ⅱ的合成分泌。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术提供一种提高罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜甙Ⅴ含量的方法，其特征在于，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞的过程中，加入酵母诱导物及茉莉酸甲酯。优选地，在所述以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中第5～7天加入酵母诱导物10～50mg/L、茉莉酸甲酯50～100μmol/L，第9～11天加入酵母诱导物100～200mg/L、茉莉酸甲酯120～260μmol/L，第17～25天收获成熟罗汉果悬浮细胞。优选地，在所述以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中第7天加入酵母诱导物为50mg/L、茉莉酸甲酯100μmol/L，第11天加入酵母诱导物为180mg/L、茉莉酸甲酯220μmol/L，第19天收获成熟罗汉果悬浮细胞。优选地，所述初代罗汉果悬浮细胞体系通过以下步骤获得：(1)取罗汉果的成熟种胚，在含有蔗糖30g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、琼脂4.6g/L、pH范围为5.5～6.0的MS半固体培养基上继代培养，选取连续继代3～5次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织；(2)将步骤(1)得到的新鲜胚性愈伤组织以接种量100g/L转接到含有蔗糖30g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、pH范围为5.5～6.5的MS液体培养基中，并在转速为150r/min、培养温度为25±2℃、光强为4000lux、光照时间为12h/d的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系。优选地，所述步骤(1)继代次数为4次。本专利技术克服了以下技术难题：以茉莉酸甲酯单独处理处于对数生长期的罗汉果悬浮细胞，处理后单位时间内罗汉果甜甙Ⅴ的合成量有所增加，但细胞褐化现象明显，总含量较正常培养组有所下降。单独添加酵母诱导物，对罗汉果甜甙Ⅴ总含量无明显影响，但罗汉果甜甙Ⅴ合成速率减缓。经过一系列的技术优化，发现在初代罗汉果悬浮细胞体系培养第5～7天，加入酵母诱导物10～50mg/L、茉莉酸甲酯50～100μmol/L；在培养第9～11天，加入酵母诱导物100～200mg/L、茉莉酸甲酯120～260μmol/L；在培养第17～25天收获成熟罗汉果悬浮细胞。使得罗汉果甜甙Ⅴ的合成速率及总含量均明显提高，苦涩味成分合成分泌明显减少，且细胞培养周期明显缩短。特别地，在培养第7天，加入酵母诱导物为50mg/L、茉莉酸甲酯100μmol/L；在培养第11天，加入酵母诱导物为180mg/L、茉莉酸甲酯220μmol/L；在培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜甙Ⅴ含量的方法，其特征在于，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞的过程中，加入酵母诱导物及茉莉酸甲酯。

【技术特征摘要】
1.一种提高罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜甙Ⅴ含量的方法，其特征在于，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞的过程中，加入酵母诱导物及茉莉酸甲酯。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中第5～7天加入酵母诱导物10～50mg/L、茉莉酸甲酯50～100μmol/L，第9～11天加入酵母诱导物100～200mg/L、茉莉酸甲酯120～260μmol/L，第17～25天收获成熟罗汉果悬浮细胞。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中第7天加入酵母诱导物为50mg/L、茉莉酸甲酯100μmol/L，第11天加入酵母诱导物为180mg/L、茉莉酸甲酯220μmol/L，第19天收获成熟罗汉果悬浮细胞。4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述初代罗汉果悬浮细胞体系通过以下步骤获得：(1)取罗汉果的成熟种胚，...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋云飞，杨文国，李元元，郭美锦，李佳瑞，王泽建，庄英萍，
申请(专利权)人：桂林莱茵生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广西,45