硝化菌(Nitrobacter)属细菌的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供一种方法，其为硝化菌(Nitrobacter)属细菌的检测方法，其具有以下工序：第一工序，该工序中，以待检DNA为模板，使用能够对序列号1所记载的碱基序列中的连续的110个碱基以上且157个碱基以下的碱基序列进行扩增的引物，使核苷酸扩增，获得扩增产物；和第二工序，该工序中，对扩增产物进行检测。

Nitrifying bacteria (Nitrobacter) is a bacterial detection method and kit.

The present invention provides a method for detecting the bacteria of the nitrifying bacteria (Nitrobacter), which has the following process: in the first process, the DNA is used as a template, using a sequence of base sequences that can be amplified by a sequence of more than 110 consecutive bases in the sequence number 1 of the base sequence and less than 157 base bases. The amplified product was obtained by nucleotide amplification, and amplification products were detected in the second step.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】硝化菌(Nitrobacter)属细菌的检测方法及试剂盒
本专利技术涉及硝化菌(Nitrobacter)属细菌的检测方法及试剂盒。
技术介绍
作为硝化细菌，已知将氨氧化成亚硝酸的氨氧化细菌(亚硝酸菌)及将亚硝酸氧化成硝酸的亚硝酸氧化细菌(硝酸菌)。这些硝化细菌承担着自然界中的氮循环反应。另一方面，在产业上硝化细菌例如在以活性污泥法为代表的废水的生物处理工艺中的氮除去中承担着重要的作用，与防止因氮盐的流出所导致的自然水域的富营养化有关。废水处理所用的活性污泥中含有各种微生物，其中，硝化菌属细菌是在氮除去中起到重要作用的亚硝酸氧化细菌中的一种。此时，期待根据废水中的氮量及废水处理所要求的处理速度，对活性污泥中的硝化菌属细菌的量进行监测、调节。因此，从存在多种微生物种的活性污泥中仅对硝化菌属细菌迅速地进行检测及定量成为课题。非专利文献1及2中记载了使用了用于检测硝化菌属细菌的规定的引物及荧光标记探针的实时PCR法。现有技术文献非专利文献1：DavidWGraham等、TheISMEJournalvol.1(2007)，p385-393非专利献2：JokeGeeks等、ApplMicrobiolBiotechnol.vol.75(2007)，p211-221
技术实现思路
专利技术要解决的技术问题但是，本专利技术者们使用非专利1及2中记载的引物及荧光标记探针、尝试从活性污泥中检测硝化菌属细菌时，结果发生检测到除硝化菌属细菌以外的细菌或者无法检测到部分硝化菌属细菌的问题。当发生这种问题时，还会对硝化菌属细菌的定量性也造成影响、变得难以控制废水中的氮除去反应。本专利技术鉴于上述事实，其目的在于提供即使在存在多种微生物种的体系中，也能够特异性地对硝化菌属细菌进行检测、定量的硝化菌属细菌的检测方法及用于其的试剂盒。用于解决技术问题的手段本专利技术者们对活性污泥中存在的硝化菌属细菌的16SrRNA基因的碱基序列(序列号18)进行克隆，新发现了特定的区域对存在多种微生物种的体系中的硝化菌属细菌的特异性检测及定量是有用的，从而完成了本专利技术。即，本专利技术例如涉及以下的[1]～[6]。[1]一种方法，其为硝化菌(Nitrobacter)属细菌的检测方法，其具有以下工序：第一工序，该工序中，以待检DNA为模板，使用能够对序列号1所记载的碱基序列中的连续的110个碱基以上且157个碱基以下的碱基序列进行扩增的引物，使核苷酸扩增，获得扩增产物；和第二工序，该工序中，对扩增产物进行检测。[2]上述[1]所述的方法，其中，第一工序中使用的引物是含有在严格条件下与含有与序列号2所记载的碱基序列互补的碱基序列的核苷酸发生杂交的18个碱基以上的碱基序列的第一引物，以及含有在严格条件下与含有序列号3所记载的碱基序列的核苷酸发生杂交的18个碱基以上的碱基序列的第二引物。[3]上述[2]所述的方法，其中，第一引物含有选自序列号4～8所记载的碱基序列中的1个碱基序列，第二引物含有选自序列号9或10所记载的碱基序列中的1个碱基序列。[4]上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，第二工序中，使用含有序列号11所记载的碱基序列的探针对扩增产物进行检测。[5]一种试剂盒，其为硝化菌(Nitrobacter)属细菌的检测中所使用的试剂盒，其含有：在严格条件下与含有与序列号2所记载的碱基序列互补的碱基序列的核苷酸发生杂交的18个碱基以上的碱基序列的第一引物，以及含有在严格条件下与序列号3所记载的碱基序列发生杂交的18个碱基以上的碱基序列的第二引物；和含有序列号11所记载的碱基序列的探针。[6]上述[5]所述的试剂盒，其中，第一引物含有选自序列号4～8所记载的碱基序列中的1个碱基序列，第二引物含有选自序列号9或10所记载的碱基序列中的1个碱基序列。专利技术效果根据本专利技术，能够提供即便在存在多种微生物种的体系中，也可特异性地对硝化菌属细菌进行检测、定量的硝化菌属细菌的检测方法及用于其的试剂盒。由此，例如在废水处理中，可以根据活性污泥中的硝化菌属细菌的检测量，对废水中的氮除去反应进行控制。具体实施方式以下对用于实施本专利技术的方式(以下称作“本实施方式”)详细地进行说明。其中，本专利技术并不限定于以下的实施方式。＜硝化菌属细菌的检测方法＞本实施方式的硝化菌属细菌的检测方法具有以下工序：第一工序，该工序中，以待检DNA为模板，使用能够对序列号1所记载的碱基序列中的连续的110个碱基以上且157个碱基以下的碱基序列进行扩增的引物，使核苷酸扩增，获得扩增产物；和第二工序，该工序中，对扩增产物进行检测。作为本实施方式的待检DNA，例如可举出质粒、cDNA、基因组DNA、从活性污泥制备的DNA。这些待检DNA也可含有多种微生物种来源的DNA。这些待检DNA的制备方法可以使用本领域技术人员公知的方法。作为待检DNA，从控制废水中的氮除去反应的观点出发，优选从活性污泥制备的DNA。作为从活性污泥制备DNA的方法，例如可以使用市售的DNA提取试剂盒等。[第一工序]序列号1表示序列号18的第901个～第1057个的碱基序列。序列号18表示硝化菌属细菌的16SrRNA基因的碱基序列。16SrRNA基因中存在基因上含有种间共通的序列的保守区域及根据种、属等不同而含有不同序列的9个可变区域(V1-V9)。序列号18中，第747个～第774个的碱基序列为V5区域，第920个～第966个的碱基序列为V6区域，第1038个～第1074个的碱基序列为V7区域。序列号1所记载的碱基序列是含有16SrRNA基因的V6及V7区域的区域。本实施方式的第一工序中，扩增产物使用能够对序列号1的碱基序列内的连续的110个碱基以上且157个碱基以下的碱基序列进行扩增的引物，对核苷酸进行扩增来制备。扩增产物也可使用能够对连续的120个碱基以上且157个碱基以下的碱基序列进行扩增的引物，对核苷酸进行扩增来制备；也可使用能够对连续的125个碱基以上且157个碱基以下的碱基序列进行扩增的引物，对核苷酸进行扩增来制备。只要是利用这种引物进行扩增所制备的扩增产物，则可以是相对于序列号1所记载的碱基序列的对应区域具有1个～2个不同核苷酸的碱基序列，也可以是具有相同核苷酸的碱基序列。通过使用上述扩增产物，在接下来的第二工序中，可以特异性地对硝化菌属细菌进行检测。作为第一工序中使核苷酸扩增、获得扩增产物的方法，并无特别限定，可以使用本领域技术人员公知的方法。作为这样的方法，例如可举出聚合酶链反应法(PCR法)、实时PCR法、LAMP法。这些方法中，由于可以与扩增同时进行第二工序的检测及进行扩增产物的定量，因而优选实时PCR法。用于获得扩增产物而使用的引物可以按照能够对含有硝化菌属细菌的16SrRNA基因的V6区域～V7区域的一部分的区域(序列号18的第901个～第1057个的碱基序列区域)进行扩增的方式进行设计。作为引物，有在严格条件下与编码16SrRNA的DNA的反义链发生杂交的第一引物(正向引物)及在严格条件下与有义链发生杂交的第二引物(反向引物)。作为第一引物，优选在严格条件下与含有与序列号2所记载的碱基序列互补的碱基序列的核苷酸发生杂交的引物。引物的长度从获得更为充分的特异性的观点出发，优选18个碱基以上。作为引物的长度上限，从进一步提高退火效本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种硝化菌(Nitrobacter)属细菌的检测方法，其具有以下工序：第一工序，该工序中，以待检DNA为模板，使用能够对序列号1所记载的碱基序列中的连续的110个碱基以上且157个碱基以下的碱基序列进行扩增的引物，使核苷酸扩增，获得扩增产物；和第二工序，该工序中，对所述扩增产物进行检测。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.03 JP 2015-0769511.一种硝化菌(Nitrobacter)属细菌的检测方法，其具有以下工序：第一工序，该工序中，以待检DNA为模板，使用能够对序列号1所记载的碱基序列中的连续的110个碱基以上且157个碱基以下的碱基序列进行扩增的引物，使核苷酸扩增，获得扩增产物；和第二工序，该工序中，对所述扩增产物进行检测。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一工序中使用的引物是含有在严格条件下与含有与序列号2所记载的碱基序列互补的碱基序列的核苷酸发生杂交的18个碱基以上的碱基序列的第一引物，以及含有在严格条件下与含有序列号3所记载的碱基序列的核苷酸发生杂交的18个碱基以上的碱基序列的第二引物。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第一引物含有选自序...

【专利技术属性】
技术研发人员：满井智和，
申请(专利权)人：住友化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP