用于产生逆转录病毒的瞬时转染方法技术

本发明专利技术涉及包含非哺乳动物复制起点且能够保持至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的逆转录病毒核酸序列：gag和pol蛋白；和env蛋白或其功能性替代物。本发明专利技术还涉及使用所述核酸载体的瞬时转染的用途和方法。

Transient transfection method for producing retrovirus

The present invention relates to a nucleic acid carrier containing a non mammal replication starting point and capable of maintaining at least 25 thousand base (KB) DNA, characterized by the nucleic acid carrier containing the encoding of retroviral nucleic acid sequences: gag and Pol protein; and Env protein or its functional substitutes. The invention also relates to the use and method of transient transfection using the nucleic acid carrier.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生逆转录病毒的瞬时转染方法
本专利技术涉及包含产生逆转录病毒所需基因的核酸载体及其用途。还提供了制备包含如本文所述的核酸载体的复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的方法。
技术介绍
在基因治疗中，将遗传物质递送至需要治疗的受试者中的内源性细胞。遗传物质可将新基因引入受试者，或引入预先存在的基因的附加拷贝，或引入存在于受试者中的基因的不同等位基因或变体。已经提出病毒载体系统作为用于基因治疗的有效基因递送方法(Verma和Somia(1997)Nature389：239-242)。特别是，这些病毒载体是基于逆转录病毒家族成员的，因为它们能够将其基因载荷整合到宿主的基因组中。逆转录病毒载体被设计用于保留包装和递送逆转录病毒基因组所需的必需蛋白，但是除去了任何非必需辅助蛋白，包括引起疾病概况的那些。逆转录病毒载体的实例包括慢病毒载体，诸如基于人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的那些，由于它们能够整合到非增殖细胞中而被广泛使用。目前，大多数病毒载体是通过将病毒基因瞬时共转染到宿主细胞系中产生的。使用存在于宿主细胞中的细菌质粒仅在有限的时间段内导入病毒基因，因为病毒基因保留在质粒上并且不整合到基因组中。因此，瞬时转染的遗传物质在细胞分裂过程中不会传递给后代。然而，存在与目前使用的瞬时转染方法相关的几个问题，诸如批次间差异性、转染试剂的高成本和难以维持质量控制(参见Segura等，(2013)ExpertOpin.Biol.Ther.13(7):987-1011)。转染过程本身也是劳动密集型的并且难以扩大规模。除去载体制备过程中遗留的质粒杂质也是困难的任务(参见Pichlmair等，(2007)J.Virol.81(2):539-47)。因此，本专利技术的目的是提供一种瞬时转染的改进方法，其克服了与现有方法相关的一个或多个缺点。
技术实现思路
本专利技术人开发了一种生产逆转录病毒载体的新方法，其涉及使用包含非哺乳动物复制起点并且能够保持至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，诸如包含逆转录病毒载体生产所必需的所有逆转录病毒基因的细菌人工染色体。瞬时转染的现有方法要求使用携带产生逆转录病毒所需的不同成分的3-4个独立质粒，将其引入宿主细胞中，这是费时的并导致与选择压力相关的问题。本专利技术人提出的方法将所有必需的逆转录病毒基因并入到单一构建体上，然后将其导入宿主细胞中，这减少了转导用于病毒载体生产的宿主细胞所需的材料的量。因此，这降低了成本，因为只使用单一载体，而不是使用多个质粒载体的先前方法。使用包含非哺乳动物复制起点并且能够保持至少25kbDNA(即，大型构建体DNA)的核酸载体具有几个优点。首先，可以先在非哺乳动物细胞(例如，微生物细胞，诸如细菌细胞)而不是哺乳动物宿主细胞中操作载体，这使得它们更易于使用(例如，细菌人工染色体可以首先在大肠杆菌中操作)。一旦制备了核酸载体，就可以将其引入宿主细胞中，诸如哺乳动物宿主细胞，以用于产生逆转录病毒载体。因此，使用本专利技术的核酸载体在生成逆转录病毒载体方面提供了优势。因此，根据本专利技术的第一方面，提供了一种包含非哺乳动物复制起点和能够保持至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的逆转录病毒核酸序列：gag和pol蛋白，和env蛋白或其功能性替代物。根据本专利技术的另一方面，提供了本文所定义的核酸载体在生产逆转录病毒载体颗粒的方法中的用途。根据本专利技术的另一方面，提供了一种生产复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的方法，包括：(a)将如本文所定义的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和(b)在生产复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的条件下培养哺乳动物宿主细胞。根据本专利技术的另一方面，提供了一种通过如本文所定义方法获得的复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。附图说明图1：构建BACpack-WTGP-277delU5和BACpack-SYNGP-277delU5的分步指南。图2：实施例2中获得的病毒滴度的比较。将106个HEK293T细胞接种在6孔板中。第二天，根据生产商说明书，将贴壁的细胞用PEI转染。细胞用总共4μg野生型(WT)慢病毒包装构建体(由pMDL.gp(GagPol)、pMD.G(VSVg)、pK-Rev(Rev)和pCCL.277(GFP转移载体)组成)转染，或用单独质粒上的2μg的BACpack(含有GagPol、VSVg和Rev的单一BAC构建体)加上2μg的eGFP转移载体转染。转染后48小时，收集上清液，通过0.22μm过滤器过滤并在-80℃下存储至少4小时。将HEK293T细胞以每孔105个细胞接种在24孔板中，以用于转导。第二天，将病毒上清液用聚凝胺进行系列稀释以8μg/ml的终浓度施加给细胞。转导后3天，通过胰蛋白酶处理收获细胞并通过FACS分析GFP。使用以下等式计算转导单位(TU)/mL的病毒滴度：(GFP阳性细胞/100)×稀释因子×转导的细胞数量。在条形图上比较病毒滴度。所有温育在37℃和5％CO2下进行。使用的培养基是补充有10％FBS和1μg/ml多西环素的DMEM，其在BACpack+转移样品中。图3：贴壁HEK293T细胞中BACpack的瞬时转染。使用磷酸钙法，用BACpackWTGP-277delU5、BACpackSYN-277delU5或标准4质粒系统瞬时转染HEK293T细胞。转染后16小时，所述+Dox条件用1μg/ml多西环素诱导24小时。转染后48小时收获病毒上清液，通过0.22μm过滤器过滤并通过转导HEK293T细胞进行滴定。GGF阳性转导的细胞用于计算转导单元/ml(TU/ml)。具体实施方式定义除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文提到的所有专利和出版物都通过引用整体并入。术语“包含(comprising)”涵盖了“包括(including)”或“由……组成(consisting)”，例如,“包含(comprising)”X的组合物可以仅由X组成或可以包括附加的某物，例如X+Y。术语“基本上由...组成”将特征的范围限制为具体的材料或步骤以及不会实质影响所要求保护的特征的基本特性的那些。术语“由......组成”排除任何附加成分的存在。关于数值x的术语“约”是指例如x±10％、5％、2％或1％。术语“载体”或“核酸载体”是指能够将外来(即外源)遗传物质人工携带到另一个细胞中的媒介物，它可以在细胞中被复制和/或表达。载体的实例包括非哺乳动物核酸载体，诸如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-衍生的人工染色体(PAC)、黏粒或福斯黏粒(fosmid)。载体的其他实例包括病毒载体，诸如逆转录病毒载体和慢病毒载体，其在本申请中特别感兴趣。慢病毒载体，诸如基于人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的那些被广泛使用，因为它们能够整合到非增殖细胞中。通过将病毒基因组分开成分离的部分，例如通过置于不同的质粒上，可以使病毒载体复制缺陷。例如，由萨尔克生物研究所(SalkInstituteforBiologicalStudies)开发的所谓的第一代慢病毒载体被构建为由安装表达盒、包膜(envelope)表达盒和载体表达盒组成的三质粒表达系统。“包装质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含非哺乳动物复制起点且能够保持至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的逆转录病毒核酸序列：gag和pol蛋白，和env蛋白或其功能性替代物，其中每种逆转录病毒核酸序列以核酸载体内的单独表达构建体排列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.24 GB 1520764.0;2016.05.26 GB 1609354.41.一种包含非哺乳动物复制起点且能够保持至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的逆转录病毒核酸序列：gag和pol蛋白，和env蛋白或其功能性替代物，其中每种逆转录病毒核酸序列以核酸载体内的单独表达构建体排列。2.如权利要求1所述的核酸载体，还包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列。3.如权利要求1或2所述的核酸载体，还包含辅助基因rev或其类似基因或功能类似系统。4.如权利要求1至3中任一项所述的核酸载体，其中载体选自：细菌人工染色体、酵母人工染色体、P1-衍生的人造染色体、福斯黏粒或黏粒。5.如权利要求4所述的核酸载体，其中载体是细菌人工染色体。6.如权利要求1至5中任一项所述的核酸载体，其中逆转录病毒核酸序列源自选自以下的逆转录病毒：慢病毒，α-逆转录病毒，γ-逆转录病毒或泡沫-逆转录病毒。7.如权利要求6所述的核酸载体，其中逆转录病毒核酸序列源自选自以下的慢病毒：HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV和Visna。8.如权利要求7所述的核酸载体，其中逆转录病毒核酸序列源自HIV-1。9.如权利要求1至8中任一项所述的核酸载体，其中env蛋白或其功能性替代物源自水泡性口膜炎病毒。10.如权利要求1至9中任一项所述的核酸载体，其还包含转录调控元件。11.如权利要求10所述的核酸载体，其中转录调控元件为CMV启动子。12.如权利要求1至11中任一项所述的核酸载体，其还包含绝缘子。13.如权利要求12所述的核酸载...

【专利技术属性】
技术研发人员：S约翰逊，C帕尔兰特，E范瓦，C文克，
申请(专利权)人：葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB