一种基于金纳米棒检测脂肪酶活的比色法制造技术

本发明专利技术涉及一种简单廉价的比色法检测脂肪酶活。本发明专利技术以金纳米棒作为换能元件，吐温作为脂肪酶识别元件，建立了检测脂肪酶活的比色法。在这个方法中，利用了吐温分子中的环氧结构以及酯基结构。吐温的环氧结构可自氧化产生过氧化氢，它作为还原剂可将溶液中的氯金酸还原成金属金沉积到金纳米棒的表面，从而改变了金纳米棒的纵横比，又由于吐温结构中存在酯基，可作为脂肪酶的底物被脂肪酶催化水解，使原来的吐温分子结构发生变化，从而控制了吐温自氧化的速度，也控制了金纳米棒的纵横比，由此发展出一种操作简单，方便快捷，灵敏准确的脂肪酶活检测的比色分析法。

A colorimetric assay for lipase activity based on gold nanorods

The invention relates to a simple and cheap colorimetric method for detecting lipase activity. The gold nanorods are used as energy exchange components, and Twain is used as a recognition element for lipase, and a colorimetric method for detecting lipase activity is established. In this method, the epoxy structure and the ester structure of Twain molecule are used. Twain's epoxy structure can produce hydrogen peroxide by self oxidation. It can be used as a reducing agent to restore the chloric acid in the solution into gold nanoparticles on the surface of gold nanorods, thereby changing the vertical and horizontal ratio of gold nanorods, and because of the existence of ester groups in the structure of Twain, which can be used as lipase catalyzed hydrolysis of lipase, so as to make the original. The Twain molecular structure changes, thus controlling the speed of Twain's self oxidation and controlling the vertical and horizontal ratio of the gold nanorods. From this, a colorimetric analysis method is developed for the simple, quick, sensitive and accurate lipase activity detection.

【技术实现步骤摘要】
一种基于金纳米棒检测脂肪酶活的比色法
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种以金纳米棒作为换能元件，吐温作为脂肪酶识别元件，用于检测脂肪酶活的纳米生物传感器。
技术介绍
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成，在快速发展的生物工程中已被视为一种重要的工业用酶，现广泛应用于奶制品、洗涤剂、食品和制药等行业。随着脂肪酶的应用领域和市场规模不断的扩大，建立一种简单、快捷、高通量及高灵敏度的脂肪酶活检测方法显得尤为重要。脂肪酶是一种界面反应酶，它的催化机理和大多数酶有所不同，其催化过程不是在均相体系中而是发生在油水界面上。现有脂肪酶活的检测方法很多，如光谱法、恒电位滴定法、色谱法、浊度法、界面张力测量法及电导法等，其中最为常用的方法是光谱法和恒电位滴定法，使用的底物主要是三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯和橄榄油等，都需要对底物进行乳化，乳化剂的加入会对酶的检测产生影响。另外，光谱法虽然操作简单快速，但是所使用的显色剂对硝基苯酚p-NPP价格昂贵，且易发生水解，对脂肪酶活的检测有较大的干扰。金纳米棒因能高灵敏度测定酶活而得到广泛的应用，LinlinLu等人利用金纳米棒头碰头连接来检测乙酰胆碱酯酶，LauraSaa等人采用金纳米棒的蚀刻来检测人体血液中的葡萄糖，JuhongChen等人基于金属离子在金纳米棒上的沉积对大肠杆菌进行检测等，这些方法基于金纳米棒构建生物传感器进行目标物检测，简化了实验步骤，并具有较高的灵敏度，在临床医学、材料科学、生命科学等领域均获得广泛的应用。现有未公开基于金纳米棒作为生物传感器来比色检测脂肪酶活的技术方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于金纳米棒用于简单、快捷、可视化的脂肪酶活检测方法。此方法首次将金纳米棒比色法与脂肪酶活检测相结合。为实现专利技术目的，本专利技术采用如下的技术方案：(1)高纵横比金纳米棒的合成；(2)吐温水解试样的制备；(3)将步骤(2)由不同脂肪酶浓度水解的吐温试样溶液加入到含有氯金酸、金纳米棒的溶液体系中，再加入缓冲溶液来调节体系的pH和离子强度，混匀，用超纯水补足至1000μL，移取200μL反应溶液到96孔酶标板中，在波长范围在400-950nm检测其吸光度，以吸光强度作为纵坐标，波长为横坐标，绘制标准曲线。本专利技术所述的检测脂肪酶活的多重比色法，步骤(1)所述使用是高纵横比的金纳米棒，金棒的纵横比为5.0。本专利技术所述的检测脂肪酶活的多重比色法，步骤(2)所述使用底物吐温的浓度为24.44mmol/L。本专利技术所述的检测脂肪酶活的多重比色法，所述的步骤(3)的缓冲溶液为磷酸(PB)缓冲溶液，该缓冲液的浓度及具体用量为本领域技术人员所理解和掌握，调节反应溶液的pH为7.0。本专利技术所述的检测脂肪酶活的多重比色法，所述的步骤(3)使用0.01mol/L磷酸(PB)缓冲溶液调节反应溶液的离子强度。本专利技术所述的检测脂肪酶活的多重比色法，所述的步骤(3)反应溶液中氯金酸的浓度为20mmol/L。附图说明图1(A)为高纵横比的金纳米棒的透射电镜(TEM)图；图(B)为包裹有金的金纳米棒的透射电镜(TEM)图。图2为机理验证图。(IHAuCl4+脂肪酶(2mg/mL)+金纳米棒(AuNRs)；II脂肪酶(2mg/mL)+吐温(3％)+金纳米棒(AuNRs)；IIIHAuCl4+脂肪酶(2mg/mL)+吐温(3％)；IVHAuCl4+吐温(3％)+金纳米棒(AuNRs)；VHAuCl4+脂肪酶(2mg/mL)+吐温(3％)+金纳米棒(AuNRs)；VIHAuCl4+金纳米棒(AuNRs)+H2O2(40μmol/L)；VIIHAuCl4+金纳米棒(AuNRs)+油酸(4mmol/L)；VIII金纳米棒(AuNRs)+H2O2(40μmol/L))。图3(A)为脂肪酶的标准曲线；(B)为脂肪酶浓度与纵向吸收峰的差值呈线性部分。具体实施方式实施例1实验机理的验证(1)步骤(1)高纵横比金纳米棒PSS的修饰将0.5mL聚4-苯乙烯磺酸(PSS)(10mg/mL)加入到5mL氯化钠(100mmol/L)中，配置完成后加入到纯化的高纵横比的金纳米棒(10000r20min离心两次)中，在30℃水浴中培养30min。(2)步骤(2)吐温试样的制备准备3个2mL离心管编号A、B、C，分别向A、B离心管中加入吐温溶液的最终浓度为3％(v/v)，C离心管不加吐温，加入相应体积的蒸馏水，分别向离心管中加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至9；后向B、C离心管中加入待测脂肪酶溶液(2mg/mL)，A离心管中不加脂肪酶溶液；混匀，调节反应温度至45℃反应45min，待用。(3)步骤(3)反应物的添加准备8个2ml的离心管编号I-VIII，首先在各离心管中加入100μmolPB缓冲溶液(160μL)，然后分别在I号管加入40μLHAuCl4(20mmol)、400μL步骤(1)制得的金纳米棒(AuNRs)和步骤(2)中C管试样400μL；II号管加入400μL步骤(1)制得的金纳米棒(AuNRs)和步骤(2)中B管试样400μL，补足体积到lmL；III号管加入40μLHAuCl4(20mmol)和步骤(2)中B管试样400μL，补足体积到1mL；IV号管加入40μLHAuCl4(20mmol)、400μL步骤(1)制得的金纳米棒(AuNRs)和步骤(2)中A管试样400μL；V号管加入40μLHAuCl4(20mmol)、400μL步骤(1)制得的金纳米棒(AuNRs)和步骤(2)中B管试样400μL；VI号管加入40μLHAuCl4(20mmol)、400μL步骤(1)制得的金纳米棒(AuNRs)和400μLH2O2(40μmol/L)；VII号管加入40μLHAuCl4(20mmol)、400μL步骤(1)制得的金纳米棒(AuNRs)和400μL油酸(4mmol/L)；VIII号管加入400μL步骤(1)制得的金纳米棒(AuNRs)和400μLH2O2(40μmol/L)，补足体积到1mL，体系添加完成后，分别移取200μL反应溶液到96孔酶标板中进行紫外分光的检测，检测结果如图2所示。由IV、V可以看到，吐温自氧化可以改变金纳米棒纵向吸收峰的位移并且随着脂肪酶的添加，切割吐温影响自氧化从而抑制金纳米棒纵向吸收峰的位移；I可以看到单独的脂肪酶对金棒的位移没有影响；II可以看出没有氯金酸的添加不会产生金覆盖在金棒的表面而改变金棒的纵横比；III可以看到没有金纳米棒是不会有其它峰产生的；VI可以看出在体系中存在过氧化氢时，金纳米棒的纵向吸收峰发生改变，已验证是吐温自氧化产生过氧化氢起到的主导作用；VII可以看出脂肪酶切割产生的油酸，对金纳米棒纵向吸收峰的位置改变没有多大的影响；VIII可以看出在体系中不存在氯金酸时，过氧化氢没有氧化作用，对金纳米棒产生蚀刻。实施例2脂肪酶酶活标准曲线的绘制(1)步骤(1)高纵横比金纳米棒PSS的修饰将0.5mL聚4-苯乙烯磺酸(PSS)(10mg/mL)加入到5mL氯化钠(100mmol/L)中，配置完成后加入到纯化的高纵横比的金纳米棒(10000r20min离心两次)中，在3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测脂肪酶活的比色法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)高纵横比金纳米棒的合成；(2)吐温水解试样的制备；(3)将步骤(2)由不同脂肪酶浓度水解的吐温试样溶液加入到含有氯金酸、金纳米棒的溶液体系中，再加入缓冲溶液来调节体系的pH和离子强度，混匀，用超纯水定容至1000μL，在室温下放置一段时间后，在波长范围在400‑950nm检测其吸光度，以吸光强度作为纵坐标，波长为横坐标，绘制标准曲线。

【技术特征摘要】
1.一种检测脂肪酶活的比色法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)高纵横比金纳米棒的合成；(2)吐温水解试样的制备；(3)将步骤(2)由不同脂肪酶浓度水解的吐温试样溶液加入到含有氯金酸、金纳米棒的溶液体系中，再加入缓冲溶液来调节体系的pH和离子强度，混匀，用超纯水定容至1000μL，在室温下放置一段时间后，在波长范围在400-950nm检测其吸光度，以吸光强度作为纵坐标，波长为横坐标，绘制标准曲线。2.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活的多重比色法，其特征在于，所述步骤(1)所述使用是高纵横比的金纳米棒，金棒的纵横比为5.0。3.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活的...

【专利技术属性】
技术研发人员：田丹碧，张凌华，朱杰，吴胜男，张浩，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32