一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，主要包括如下步骤：(1)斑马鱼选取；(2)斑马鱼的最佳发育阶段的确定；(3)斑马鱼的最佳数量的确定；(4)待测药物在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性检测。本发明专利技术还涉及了一种运用该方法在筛选、评价胰脂肪酶抑制剂中的应用，主要包括如下步骤：(1)斑马鱼选取；(2)供试品处理；(3)测定吸光值并计算胰脂肪酶活性抑制率。本发明专利技术提供的检测方法，具有简单、高效、快速等优点，可应用于筛选胰脂肪酶抑制剂，实现体内高通量筛选胰脂肪酶抑制剂，对肥胖症或体重超重患者的治疗有着重要意义。

A method for detecting pancreatic lipase activity in zebrafish and its application

The present invention discloses a method for detecting the activity of pancreatic lipase in zebrafish, including the following steps: (1) the selection of zebrafish; (2) determination of the optimum development stage of zebrafish; (3) determination of the optimum number of zebrafish; (4) detection of pancreatic lipase activity in zebrafish body. The invention also relates to the application of the method in screening and evaluating the inhibitors of pancreatic lipase, including the following steps: (1) zebrafish selection; (2) the test product treatment; (3) determine the absorption value and calculate the inhibitory rate of pancreatic lipase activity. The detection method provided by this invention is simple, efficient and fast. It can be used in screening pancreatic lipase inhibitors and high throughput screening of pancreatic lipase inhibitors in vivo. It is of great significance for the treatment of obesity or overweight patients.

【技术实现步骤摘要】
一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法与应用
本专利技术属于药物评价与筛选的
，具体涉及一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶的方法，以及运用该方法在筛选胰脂肪酶抑制剂中的应用。
技术介绍
肥胖可引发心血管疾病(心力衰竭和中风)、糖尿病、高血脂症、阻塞性睡眠呼吸暂停、哮喘、肌肉骨骼疾病、癌症等，严重危及人类健康[1]。近年来，通过减少脂肪吸收而达到减肥，已经成为有效治疗肥胖症的手段之一[2]。胰脂肪酶(lipase)是一种由胰腺分泌的脂肪分解酶，能够分解人体摄入的脂肪类物质，脂肪分解后被人体吸收。因此，具有抑制胰脂肪酶活性的物质具有减少人体脂肪吸收的作用，通过研究胰脂肪酶抑制剂可以获得防治肥胖的物质[3]。胰脂肪酶抑制剂作为一种作用于肠道内的减肥药物，不进入血液，不会产生中枢神经性副作用，不影响矿物质代谢，已成为近年来研究的热点。目前，唯一上市的减肥药奥利司他(Orlistat)，通过抑制胰脂肪酶活性，减少饮食中脂肪的吸收从而达到减轻体重的目的[4]，为肥胖症的治疗开辟了新的途径，但是存在胃肠道不良反应，表现为油性斑点、带便性胃肠排气、大便紧急感[5-7]等；所以开发出安全性更高，副作用更小的新型胰脂肪酶抑制剂意义重大；在本专利中提出一种新型的高通量胰脂肪酶抑制剂筛选的方法；斑马鱼是一种新颖的模式生物，与传统的体内和体外筛选模型相比较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、操作复杂、成本高的弊端。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85％左右，实验结果可比性强，与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[8-11]。更重要的是，斑马鱼具有与生俱来的优点[12]：①饲养成本低，性成熟周期短；②繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200～300枚卵；③生长发育速度快，在受精24h后，斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；④胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；⑤胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食，可避免供试品处理时供试品与食物成份的相互作用；⑥胚胎体积小，幼鱼体长只有1-4mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；⑦给药方式简单：溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。斑马鱼幼鱼之所以适合整体动物研究脂质代谢，是因为斑马鱼与哺乳动物相比拥有许多相同胃肠器官，而且脂质代谢过程高度相似[13-14]。目前，评价减肥药物的胰脂肪酶抑制作用，通常采用鼠类、犬类等哺乳动物模型进行评价，其缺点在于：动物饲养成本高、评价模型的建模复杂、评价实验周期长、难以高通量筛药等；而应用斑马鱼模型去检测胰脂肪酶的活性，并应用该检测方法去筛选、评价胰脂肪酶抑制剂的功效，现有技术并未涉及。因此，如何建立一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，并以此用于筛选、评价胰脂肪酶抑制剂的功效，是本领域技术人员急需借鉴的技术难题。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，并用于筛选、评价胰脂肪酶抑制剂的功效，解决了上述现有技术中所提到相关缺陷。为实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，包括如下步骤：(1)斑马鱼选取取4～5对斑马鱼亲本交配、孵化，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼；(2)斑马鱼的最佳发育阶段的确定用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理不同发育阶段的斑马鱼，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同发育阶段的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定最佳的斑马鱼发育阶段；所述不同发育阶段的斑马鱼为受精后3天(3dpf)、受精后4天(4dpf)或受精后5天(5dpf)的斑马鱼；所述最佳发育阶段的斑马鱼为受精后5天(5dpf)的斑马鱼；(3)斑马鱼的最佳数量的确定用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理不同数量的斑马鱼，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同数量的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定最佳的斑马鱼数量；所述不同数量的斑马鱼为2尾/孔、4尾/孔；所述最佳数量的斑马鱼为2尾/孔；(4)待测药物在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性检测用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理含有不同浓度的待测药物的5dpf斑马鱼，斑马鱼数量为2尾/孔，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为空白对照组；用p-NPP处理不含待测药物的5dpf斑马鱼，作为正常对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同浓度的待测药物在斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定待测药物的最佳浓度。优选的，所述的养殖用水的环境条件为：水中溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为28℃、pH为7.2-7.6、总硬度为200-250mg/L。优选的，所述的微孔板分析步骤为：先将处理后的斑马鱼放入96孔板，再将微孔板置于多功能微孔板分析仪下测定吸光值。优选的，所述的待测药物选用奥利司他，步骤(4)中分别选用0.012μg/mL、0.12μg/mL、1.2μg/mL和12μg/mL浓度的奥利司他处理斑马鱼，且待测药物的最佳处理浓度为12μg/mL。本专利技术还公开了一种如前所述的检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，在筛选胰脂肪酶抑制剂中的应用。优选的，该方法应用于筛选胰脂肪酶抑制剂的步骤为：(1)斑马鱼选取取4～5对斑马鱼亲本交配、孵化，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼；(2)供试品处理设如下实验组：供试品处理组：供试品以溶解的方式给药，初筛浓度为30μM；底物对照组：用胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理的养殖用水；正常对照组：用胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理的5dpf、2尾的斑马鱼；溶剂对照组：用0.1％DMSO处理的5dpf、2尾的斑马鱼；阳性对照组：用12μg/mL奥利司他处理的5dpf、2尾的斑马鱼；上述实验组均在96孔板中进行，每孔2尾斑马鱼，100μl反应液，每个实验组处理6个孔，在28℃反应24小时；(3)测定吸光值并计算胰脂肪酶活性抑制率反应结束后，测定各实验组的吸光值，并计算胰脂肪酶活性抑制率，计算公式如下：统计学处理计算结果，比较各实验组在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性抑制水平，判断并确定供试品是否具有抑制胰脂肪酶活性的作用，以评价胰脂肪酶抑制剂的功效。本专利技术中，专利技术人建立了一种检测药物在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性的方法，该方法的重点在于斑马鱼的最佳发育阶段的确定、斑马鱼的最本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，包括如下步骤：(1)斑马鱼选取取4～5对斑马鱼亲本交配、孵化，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼；(2)斑马鱼的最佳发育阶段的确定用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p‑NPP处理不同发育阶段的斑马鱼，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同发育阶段的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定最佳的斑马鱼发育阶段；所述不同发育阶段的斑马鱼为受精后3天(3dpf)、受精后4天(4dpf)或受精后5天(5dpf)的斑马鱼；所述最佳发育阶段的斑马鱼为受精后5天(5dpf)的斑马鱼；(3)斑马鱼的最佳数量的确定用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p‑NPP处理不同数量的斑马鱼，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同数量的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定最佳的斑马鱼数量；所述不同数量的斑马鱼为2尾/孔、4尾/孔；所述最佳数量的斑马鱼为2尾/孔；(4)待测药物在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性检测用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p‑NPP处理含有不同浓度的待测药物的5dpf斑马鱼，斑马鱼数量为2尾/孔，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为空白对照组；用p‑NPP处理不含待测药物的5dpf斑马鱼，作为正常对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同浓度的待测药物在斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定待测药物的最佳浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种检测斑马鱼体内胰脂肪酶活性的方法，包括如下步骤：(1)斑马鱼选取取4～5对斑马鱼亲本交配、孵化，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼；(2)斑马鱼的最佳发育阶段的确定用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理不同发育阶段的斑马鱼，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同发育阶段的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定最佳的斑马鱼发育阶段；所述不同发育阶段的斑马鱼为受精后3天(3dpf)、受精后4天(4dpf)或受精后5天(5dpf)的斑马鱼；所述最佳发育阶段的斑马鱼为受精后5天(5dpf)的斑马鱼；(3)斑马鱼的最佳数量的确定用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理不同数量的斑马鱼，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同数量的斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定最佳的斑马鱼数量；所述不同数量的斑马鱼为2尾/孔、4尾/孔；所述最佳数量的斑马鱼为2尾/孔；(4)待测药物在斑马鱼体内的胰脂肪酶活性检测用40μg/mL的胰脂肪酶荧光检测试剂p-NPP处理含有不同浓度的待测药物的5dpf斑马鱼，斑马鱼数量为2尾/孔，并加入100μl反应液，作为实验组；底物对照组为不含斑马鱼的反应液，作为空白对照组；用p-NPP处理不含待测药物的5dpf斑马鱼，作为正常对照组；各组在养殖用水中反应24小时，反应结束后，微孔板分析并测定吸光值，并通过统计学处理数据，比较不同浓度的待测药物在斑马鱼体内胰脂肪酶的活性强弱，判断并确定待测药物的最佳浓度。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞航萍，劳乔聪，李春启，
申请(专利权)人：杭州环特生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33