一种霍乱弧菌菌影制备方法及其在家禽疫苗中的应用技术

本发明专利技术涉及基因工程疫苗领域，具体公开了一种霍乱弧菌菌影及其在畜禽疫苗中的应用。本发明专利技术将霍乱弧菌E1 Tor野生株经过E裂解蛋白的诱导裂解以及随后的冻干处理后获得的完整细菌空壳，即霍乱弧菌菌影，并将其作为兽用疫苗佐剂，优化使用剂量为新城疫弱毒疫苗、灭活疫苗1000羽份疫苗添加20‑40mg霍乱弧菌菌影，经点眼、滴鼻、或肌肉注射的免疫途径进行免疫后，可有效介导Th1型细胞免疫，增强动物机体对胞内寄生菌和病毒的抵抗能力。本发明专利技术的霍乱弧菌菌影佐剂可以与鸡新城疫弱毒疫苗、新城疫灭活疫苗配合使用，具有安全性高、成本低廉、稳定性高和增强疫苗清除病原的功效。

Preparation method of Vibrio cholerae bacterin and its application in poultry vaccine

The invention relates to the field of genetic engineering vaccine, and discloses a Vibrio cholerae bacterin and its application in livestock and poultry vaccines. In this invention, the E1 Tor wild strain of Vibrio cholerae was induced by the induced cracking of E lysis protein and the subsequent freeze-dried treatment of Vibrio cholerae, that is, Vibrio cholerae bacterin, and used it as a adjuvant for veterinary vaccine, and optimized the dosage of new castle disease vaccine and inactivated vaccine 1000 plume vaccine to add 20 Vibrio cholerae. After immunization with the immunization of the eye, nose, or intramuscular injection, the immunization of Th1 type cells can be effectively mediated, and the resistance of the animals to the intracellular parasites and viruses can be enhanced. The bacteric adjuvant of Vibrio cholerae can be used in combination with the Newcastle disease vaccine and the inactivated Newcastle disease vaccine, and has the efficacy of high safety, low cost, high stability and strengthening the vaccine to remove the pathogen.

【技术实现步骤摘要】
一种霍乱弧菌菌影制备方法及其在家禽疫苗中的应用
本专利技术涉及基因工程疫苗领域，具体地说，涉及一种霍乱弧菌菌影及其在家禽疫苗中的应用。
技术介绍
霍乱弧菌菌影(Vibriocholeraghosts，CG)是通过基因遗传操作将PhiX174的裂解基因E导入野生型E1Tor菌株中，通过诱导表达E基因使细菌细胞壁穿孔，细菌胞浆内容物外流，最终获得具有免疫原性的菌体外壳。传统兽用疫苗为灭活疫苗，常采用加热、放射或是化学试剂处理灭活抗原，这些方法容易造成菌体抗原表位的变性，从而影响免疫效果，变性剂的残留还可能影响环境及动物本身的安全。相比之下，菌影不仅能够保持细菌抗原表位的天然结构，而且可以将外源蛋白锚定于菌影包膜上，制备成多价疫苗。此外，菌影制备、纯化工艺简单，适合大量生产，而且产品可以常温长期保存，不必担心效价的降低。菌影具有安全、高效、成本低廉的特点，将其应用于兽用疫苗将有效的预防各类动物传染性疾病。研究发现霍乱弧菌具有良好的黏膜免疫刺激效果，霍乱弧菌感染后小肠内可迅速出现分泌型lgA，局部的SIgA在肠粘膜与病菌之间形成免疫屏障，可阻断病原粘附和中和毒素。此外，霍乱弧菌自身具有佐剂特性，经无害化处理得到的霍乱弧菌菌影(choleraghost，CG)不仅保持原有抗原结构和功能的完整，还能够装载外源的抗原蛋白，有效的刺激抗原递呈细胞，其佐剂效力甚至优于铝佐剂和完全弗氏佐剂等常用佐剂，黏膜免疫比其它途径免疫有以下优点:使用方便，副作用少，便于多次加强免疫。然而，目前尚无关于将CG应用于家禽、家畜等的兽用疫苗的研究报道，因此CG在该方面的应用研究还有待进一步开发。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种霍乱弧菌菌影及其在作为畜禽疫苗佐剂中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供一种用于黏膜免疫和体液免疫的霍乱弧菌菌影(CG)。所述CG为霍乱弧菌经过E裂解蛋白的诱导裂解以及随后的冻干处理后获得的完整细菌空壳冻干粉。本专利技术所提供的霍乱弧菌菌影重组蛋白的冻干粉，命名为BG/312，其外观为白色棒状颗粒，用无菌磷酸盐缓冲液重溶后为悬浊液体，无任何活菌残留。进一步地，所述霍乱弧菌菌影的制备方法包括如下步骤：(1)构建含有裂解蛋白E基因的重组质粒；(2)制备霍乱弧菌感受态细胞；(3)将步骤(1)所得重组质粒转化进入步骤(2)所述的感受态细胞中；(4)诱导菌体裂解及鉴定；(5)菌影的收集和保存。进一步地，步骤(1)中所述重组质粒的制备方法为：利用高保真PCR方法获得带有特异性酶切位点的裂解蛋白E基因片段(NC001422.1)，纯化回收后，SalI、EcoRI限制性内切酶酶切获得目的片段，将酶切后的裂解基因E片段连接进入pBAD-24质粒，即获得所述重组质粒pBAD-sE(见图1)。所述步骤(2)选用霍乱弧菌E1Tor株制备霍乱弧菌感受态细胞，属于野生菌株，具有一定的腹泻致病性，ATCC编号14033，血清型为O1，购自美国ATCC中心。所述步骤(2)具体为：取出保存的菌种，划线接种于LB平板，于36-38℃温箱中培养过夜；待平板上长出直径1-2mm菌落的时候，从平板上挑取单个菌落，接种至含有LB培养液的试管中，36-38℃振荡培养过夜；次日取菌液接种至含有LB培养基的培养瓶中，36-38℃剧烈震荡培养2-3小时，直到OD600＝0.4-0.5，停止培养；将培养瓶取出置于冰上，待菌液温度降至4℃左右时，无菌条件下把菌液倒入离心管中，4℃条件下离心；弃上清，吸干残留的培养液，加预冷的2mM的CaCl2到离心管中，轻轻吹打混匀，悬浮菌体，冰浴；之后，4℃条件下离心，弃上清，重复清洗2次，加预冷的0.1M的CaCl2含有10％甘油的2mM的CaCl2重悬浮菌体；离心后，4℃预冷的10％甘油重悬菌体，并将其分装到预冷的灭菌离心管中，于-80℃低温保存。所述步骤(3)具体为：将感受态细胞置于冰浴中，使其融化；将重组质粒加入到刚融化的感受态细胞中，轻摇混匀，冰浴5min后；1800V，200Ω条件下电击，结束后，加入适量的无抗性LB培养基，迅速放入42℃水浴中热激90s，再冰浴5min；加入预热至37℃的LB液体培养基，于36-38℃的摇床中振荡1-2h；取菌液直接涂布一个LB/Amp平板；剩余菌液常温下离心收集细胞，再加入新鲜的LB液体培养基，轻轻吹打混匀后，涂布第二个LB/Amp平板；将两个梯度涂布菌液的LB/Amp平板，倒置放入37℃培养箱中培养12-16h。所述步骤(4)具体为：挑取鉴定阳性的单个菌落，接种于新鲜的LB/Amp培养液中，36-38℃摇床过夜培养；之后将菌液接种于新鲜的LB/Amp培养液中，同样条件下增菌培养；在两个三角瓶中分别加入LB/Amp培养液，用新鲜培养液调整初始菌液浓度至OD600＝0.4-0.5；36-38℃摇床培养至OD600＝0.4左右时，加入终浓度为0.1％-0.2％的Arabinose，诱导重组质粒的E基因表达裂解蛋白，裂解菌体，直到OD600小于0.3，将菌液分装到离心管中，置于冰上使菌液完全冷却，8000rpm、4℃离心30min收获菌体，之后依次用预冷的去离子水、预冷的PBS-SP和预冷的PBS-S重悬菌体，每次重悬后均进行冰浴和高速离心；最后用预冷的PBS-S重悬菌体，即得。本专利技术使用的重组质粒能够高效裂解霍乱弧菌，将细菌内容物全部释放而仅存细菌外壳，再经冷冻干燥后可获得无任何活菌残留的菌影。经动物实验后，猪、鸡等均无任何不良反应，达到了安全无毒的使用标准，具有较大的应用前景。本专利技术所述的霍乱弧菌菌影(CG)是通过调控噬菌体PhiX174的裂解基因E在霍乱弧菌中表达而形成的无细胞浆和繁殖能力的完整细菌空壳。霍乱弧菌菌影制备过程温和且无需变性作用，完好地保留了菌体表面结构和各种抗原成分，具有良好的免疫原性和内在佐剂性。霍乱弧菌菌影的最大优势在于对黏膜免疫有良好的刺激性，而且易于被免疫系统所识别、能够诱导机体产生良好的体液、细胞免疫应答。此外，霍乱弧菌菌影易于大量生产，易于纯化，只需常规的离心机离心收集，经冷冻干燥处理后的菌影可以常温下长期保存。不仅如此，本专利技术所述的霍乱弧菌菌影完好地保留了菌体外膜结构、相关抗原蛋白和免疫刺激成分，因而具有内在的免疫佐剂性和免疫系统靶向性，能有效诱导机体产生体液免疫应答、细胞免疫应答以及免疫保护反应。经免疫试验证实，经CG佐剂免疫后血清抗体水平及其杀菌活性以及攻毒后的相对免疫保护率均显著高于传统的灭活苗、弱毒疫苗，实现较高水平的呼吸道免疫，有效防止畜禽衣原体、家禽新城疫的流行和爆发。第二方面，本专利技术还提供了所述霍乱弧菌菌影作为免疫佐剂在制备疫苗中的应用。经本专利技术研究发现，本专利技术所述的霍乱弧菌菌影与兽用活疫苗以及灭活疫苗混合后使用，可以增强当前使用疫苗的体液免疫和细胞免疫，清除细胞内胞内菌感染以及病毒感染，提高疫苗的免疫效果。因此，所述应用具体为将霍乱弧菌菌影作为免疫佐剂与禽畜疫苗搭配使用，所述禽畜疫苗可为活疫苗或灭活疫苗。作为优选，所述禽畜疫苗为禽流感疫苗(例如禽流感H9N2疫苗、新城疫灭活疫苗或新城疫弱毒疫苗，用于防治家禽新城疫和禽流感H9N2等)。更为优选，本专利技术优化了霍乱弧菌菌影与疫苗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于黏膜免疫和体液免疫的霍乱弧菌菌影，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：(1)构建含有裂解蛋白E基因的重组质粒；(2)制备霍乱弧菌感受态细胞；(3)将步骤(1)所得重组质粒转化进入步骤(2)所述的感受态细胞中；(4)诱导霍乱弧菌菌体裂解及鉴定；(5)菌影的收集和冻干保存。

【技术特征摘要】
1.一种用于黏膜免疫和体液免疫的霍乱弧菌菌影，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：(1)构建含有裂解蛋白E基因的重组质粒；(2)制备霍乱弧菌感受态细胞；(3)将步骤(1)所得重组质粒转化进入步骤(2)所述的感受态细胞中；(4)诱导霍乱弧菌菌体裂解及鉴定；(5)菌影的收集和冻干保存。2.根据权利要求1所述的霍乱弧菌菌影，其特征在于，步骤(1)中所述重组质粒的制备方法为：利用高保真PCR方法获得带有特异性酶切位点的裂解蛋白E基因片段，纯化回收后，SalI、EcoRI限制性内切酶酶切获得目的片段，将酶切后的裂解基因E片段连接进入pBAD-24质粒，即获得所述重组质粒pBAD-sE。3.根据权利要求2所述的霍乱弧菌菌影，其特征在于，所述步骤(2)选用霍乱弧菌E1Tor株制备霍乱弧菌感受态细胞。4.根据权利要求3所述的霍乱弧菌菌影，其特征在于，所述步骤(2)具体为：取出保存的菌种，划线接种于LB平板，于36-38℃温箱中培养过夜；待平板上长出直径1-2mm菌落的时候，从平板上挑取单个菌落，接种至含有LB培养液的试管中，36-38℃振荡培养过夜；次日取菌液接种至含有LB培养基的培养瓶中，36-38℃剧烈震荡培养2-3小时，直到OD600＝0.4-0.5，停止培养；将培养瓶取出置于冰上，待菌液温度降至4℃左右时，无菌条件下把菌液倒入离心管中，4℃条件下离心；弃上清，吸干残留的培养液，加预冷的2mM的CaCl2到离心管中，轻轻吹打混匀，悬浮菌体，冰浴；之后，4℃条件下离心，弃上清，重复清洗2次，加预冷的0.1M的CaCl2含有10％甘油的2mM的CaCl2重悬浮菌体；离心后，4℃预冷的10％甘油重悬菌体，并将其分装到预冷的灭菌离心管中，于-80℃低温保存。5.根据权利要求1所述的霍乱弧菌菌影，其特征在于，所述步骤(3)具体为：将感受态细胞置于冰浴中，使其融化；将重组质粒加入到刚融...

【专利技术属性】
技术研发人员：何诚，李小慧，何润春，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11