一种过氧化氢荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种过氧化氢荧光探针及其制备方法和应用。该探针分子式为C34H38N3O7B，具有如下所示结构：

【技术实现步骤摘要】
一种过氧化氢荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种过氧化氢荧光探针其制备方法和应用，属于过氧化氢探针的制备

技术介绍
过氧化氢俗称双氧水，纯的过氧化氢是淡蓝色的粘稠液体，其水溶液为无色透明液体，一般用于物体表面消毒。目前，环境中过氧化氢主要来源于有机化合物的代谢和降解。过氧化氢也是人体内源性物质，主要是由新陈代谢时，物质氧化分解过程中产生。研究发现，过氧化氢在生物体系的病理生理过程中扮演重要角色。在生物体内，充当多种信号转导过程的信号传导分子。过氧化氢不仅可以作为其他活性氧的生成前提，也可以作为其他活性氧相关反应的副产物发挥重要的生理功能。然而，当人体内过氧化氢浓度高于正常生理水平时，就会造成机体损伤，引发诸多疾病，包括癌症、糖尿病、心血管疾病、神经性疾病以及阿尔兹海默病等。因此，设计并合成特异性好、灵敏度高、并具有良好的生物相容性的荧光探针，能够实时准确地对生物体内的过氧化氢浓度进行检测和成像对于疾病的预防、诊断、检测、治疗以及病理生理的深入研究都具有重要的指导意义。目前，主要通过分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法等检测手段来检测过氧化氢。这些方法一般适用于检测水溶液和食品中的过氧化氢，并不适于生物环境的过氧化氢的检测，因为它们的检测灵敏度有限并且对生物样品具有破坏性。近年来，小分子有机荧光探针受到科学界的广泛关注，它与特定目标分析物发生作用后，荧光信号会发生变化，以达到检测目的。利用荧光探针的荧光分析法具有特异选择性、高灵敏度、响应时间快等特征，并且对细胞内目标分子进行非侵入性成像检测可以实时在线，形象具体地观察到信号变化。所以，专利技术能快速检测、易观查信号变化的过氧化氢荧光探针是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能快速检测过氧化氢的荧光探针，并进一步提供了该探针的制备方法和应用。本专利技术采用以下技术方案：一种过氧化氢荧光探针，其分子式为C34H38N3O7B，具有如下所示结构：所述的过氧化氢荧光探针，其对过氧化氢的响应时间为60分钟左右。所述的过氧化氢荧光探针，其能抗O2-、NO、ClO-、过氧化氢叔丁醇、OH-、O2-、L-半胱氨酸、L-谷胱甘肽、硫化氢、Fe3+、NO3-、NO2-和苯并氨酸、丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸和组氨酸的干扰。一种上述的过氧化氢荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：1)将溴代萘酸酐1.0mmol溶解于乙醇中，随后加入2.0mmol乙二胺，80℃下回流反应0.5小时，反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品，并用硅胶层析柱纯化得到纯净化合物1；2)将1.0mmol化合物1和1.0mmol二乙氨基香豆素酸、1.5mmolEDCI、2.5mmolHOBT溶解于二氯甲烷中，然后在常温和搅拌条件下反应6小时以上，反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品，并用硅胶层析柱纯化得到纯净化合物2；3)将0.1mmol化合物2和0.2mmol联硼酸频哪醇酯、0.2mmol乙酸钾、0.01mmol[1，1，-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯溶解于1,4-二氧六环中，然后在无水无氧、氮气保护和90℃条件下搅拌反应10小时以上，反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品，并用硅胶层析柱纯化得到目标探针化合物。所述步骤(1)中柱层析所用洗脱剂为二氯甲烷与乙醇体积比50：1组成。所述步骤(2)中柱层析所用洗脱剂为二氯甲烷与乙醇体积比50：1组成。所述步骤(3)中柱层析所用洗脱剂为二氯甲烷与乙醇体积比50：1组成。本专利技术所述探针的合成路线如下：本专利技术速制备的过氧化氢荧光探针可以用于检测水环境中的过氧化氢和生物样品的过氧化氢。上述应用，具体的，包括：观察加入过氧化氢荧光探针前后待测水环境的荧光光谱的变化；荧光激发波长为410nm；或者，观察加入过氧化氢荧光探针前后待测生物环境的荧光成像图的变化。所述生物环境，可以是活细胞。所述荧光光谱的变化是指：荧光光谱中，在475nm和548nm处的荧光峰值的变化；如果475nm处峰值变小，且548nm处峰值变大，则说明含有过氧化氢。优选的，采用荧光光谱仪观察荧光光谱。所述荧光变化是指：在365nm光源照射下，荧光由绿色荧光变为蓝色荧光；所述荧光成像图的变化是指：从观察不到荧光到观察到红色荧光。优选的，采用荧光光谱仪观察荧光光谱。上述应用，具体的，包括以下步骤：(1)将探针化合物溶于乙醇，制成探针母液；(2)将探针母液加入到待测液中；用荧光光谱仪测试待测液的荧光光谱，在475nm和548nm处的荧光峰值的变化；如果475nm处峰值变小，且548nm处峰值变大，则说明含有过氧化氢；其中，荧光光谱仪激发波长为410nm；(3)将探针母液加入到生物样品中，用共聚焦显微镜，使用激发波长为514nm的光源激发，分别收集460-490nm和545-575nm范围的荧光；观察到蓝色荧光变成红色荧光，则说明含有过氧化氢。首先，水溶液中的过氧化氢可以引起荧光探针的荧光光谱变化，因此，可以通过观察荧光光谱仪中光谱的变化程度判断溶液中的过氧化氢含量，从而定量检测；其检测下限为1.4×10-6mol/L。其次，通过共聚焦显微镜对孵育了荧光探针II和过氧化氢的活细胞进行荧光成像，观察蓝色和绿色通道荧光信号的变化以达到比值检测生物环境中的过氧化氢的目的。另外，利用本专利技术的探针，采用荧光光谱仪测试水溶液的过氧化氢时，在60分钟左右荧光光谱的峰值达到稳定；具备反应时间短的优势，实现了快速检测。本专利技术的优点：(1)探针合成简单，并且产率较高；(2)本专利技术实现了水溶液中过氧化氢的特异性和快速检测；(3)本专利技术实现了活细胞水平中过氧化氢的检测。附图说明图1是实施例1中化合物2的1HNMR图谱。图2是实施例1中化合物2的13CNMR图谱。图3是实施例1中探针化合物的1HNMR图谱。图4是实施例1中探针化合物的13CNMR图谱。图5是实施例2中探针化合物随不同量过氧化氢的加入荧光谱图的变化情况；图中，过氧化氢浓度依次为0、5、10、20、30、40、50、70、100、120、150、200μmol/L的荧光光谱。图6是探针化合物(10μM)在PBS缓冲溶液(浓度25mmol/L，pH7.4，含25％乙醇)与5、10、20当量过氧化氢在60分钟内荧光强度比值(I551/I480)变化的线状图，激发波长为410nm。图7是探针化合物(10μM)在PBS缓冲溶液(浓度25mmol/L，pH7.4，含25％乙醇)与不同分析物反应后的荧光强度比值变化柱状图。激发波长为410nm。1，空白；2，O2-；,3，NO；4，ClO-；5，过氧化氢叔丁醇；6，OH-；7，O2-；8，L-半胱氨酸；9，L-谷胱甘肽；10，硫化氢；11，Fe3+；12，NO3-；13，NO2-；14，苯并氨酸；15，丙氨酸；16，色氨酸；17，丝氨酸；18，天冬氨酸；19，异亮氨酸；20，组氨酸；21，过氧化氢。图8是探针化合物(5μM)与HeLa细胞中过氧化氢响应的荧光成像图；图中，(A1-4)是加入5μM探针II孵育30分钟后的荧光成像，随后加入(B1-4)30，(C1-4)75或(D1-4)150μmol/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种过氧化氢荧光探针，其特征在于，其分子式为C34H38N3O7B，具有如下所示结构：

【技术特征摘要】
1.一种过氧化氢荧光探针，其特征在于，其分子式为C34H38N3O7B，具有如下所示结构：2.根据权利要求1所述的过氧化氢荧光探针，其特征在于，其对过氧化氢的响应时间为60分钟。3.根据权利要求1或2所述的过氧化氢荧光探针，其特征在于，其能抗O2-、NO、ClO-、过氧化氢叔丁醇、OH-、O2-、L-半胱氨酸、L-谷胱甘肽、硫化氢、Fe3+、NO3-、NO2-和苯并氨酸、丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸和组氨酸的干扰。4.一种权利要求3所述的过氧化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：1)将溴代萘酸酐1.0mmol溶解于乙醇中，随后加入2.0mmol乙二胺，80℃下回流反应0.5小时，反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品，并用硅胶层析柱纯化得到纯净化合物1；所述化合物1的结构式如下所示：2)将1.0mmol化合物1和1.0mmol二乙氨基香豆素酸、1.5mmolEDCI、2.5mmolHOBT溶解于二氯甲烷中，然后在常温和搅拌条件下反应6小时以上，反应完毕后，通过旋转蒸发仪减...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，何隆薇，徐凯欣，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37