一体式刚性流道液滴数字PCR系统及方法技术方案

本发明专利技术公开一体式刚性流道液滴数字PCR系统，包括液滴发生装置、刚性热循环流道、热循环温度控制器以及荧光检测控制器。本发明专利技术采用刚性热循环管道具有高的导热性能，同时刚性壁面粗糙度低，相对变形量小，同时采用承压能力强的液滴发生装置以及末端荧光检测系统能够对液滴进行实时在线检测，具有温度控制灵活，系统安全，不需要特制PCR反应芯片，荧光检测通量高，灵敏度高等特点。同时避免传统液滴数字PCR设备需要将液滴在不同模块中进行转移而造成液滴破碎以及液滴之间相互融合，进而导致测量精度降低等问题。整个系统实现以液滴生成，PCR反应热循环以及末端液滴荧光实时在线检测的高度一体化设计。

Integrated rigid channel droplet digital PCR system and method

The invention discloses an integrated rigid flow channel digital PCR system, which includes a liquid drop generating device, a rigid hot circulation flow channel, a thermal cycle temperature controller and a fluorescence detection controller. The rigid hot circulation pipe has high thermal conductivity, low roughness of rigid wall, small relative deformation, and the liquid drop generator with strong pressure bearing capacity and the end fluorescence detection system can detect the droplet in real time. It has the flexibility of temperature control, system safety and no special PCR. The reaction chip has the characteristics of high flux and high sensitivity. At the same time, it is necessary to avoid the traditional droplet digital PCR equipment to transfer the droplets in different modules and cause the drop of droplets and the fusion of droplets, which will lead to the reduction of measurement precision. The whole system realizes highly integrated design with droplet generation, PCR reaction thermal cycle and real-time droplet fluorescence real-time detection.

【技术实现步骤摘要】
一体式刚性流道液滴数字PCR系统及方法
本专利技术涉及一体式刚性流道液滴数字PCR系统及方法，属于医疗器械领域，适合于要求高通量，在线检测以及对扩增模板进行完全定量的聚合酶链式反应(PCR)。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种非常重要的核酸分析方法，得益于能够快速对目标分子进行大量扩增，广泛应用于生命科学领域领域。传统的PCR仪器由于液体体积量大，需要循环复杂的加热和冷却循环，不能够进行绝对定量分析。数字PCR技术是近年快速发展的新型PCR技术，可以样品中的分子数进行绝对定量。基本原理是通过将一个样本分成几十到几十万份甚至更多，每个分子分配到不同的反应单元，每个单元至多包含一个拷贝的目标分子，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，其应用领域包括：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。基于这些优势液滴数字PCR被广泛的应用低模板浓度目标分子的检测。现有基于液滴数字PCR设备通常将整个循环分为三个部分：液滴发生装置(2)，热循环控制器和液滴荧光检测器，需要液滴在各个模块中进行转移，在转移过程中容易造成液滴破碎以及液滴之间相互融合，导致有效数据减少，降低结果可行度等问题。
技术实现思路
本专利技术技术解决的问题：克服现有技术的不足，所专利技术的一体式刚性流道液滴数字PCR系统及方法，具有高度的一体化设计，集成承压能力强的液滴发生装置(2)并采用刚性热循环流道装置，具有高导热性的同时能够有效的抑制液滴破碎与样品之间的交叉污染。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一体式刚性流道液滴数字PCR系统，包括：液滴发生装置、液滴PCR反应模组、荧光检测控制器；动力装置包括反应试剂推进器(6)及油相推进器(7)；液滴PCR反应模组(3)包括刚性热循环模块(8)和热循环温度控制器(15)；试剂分两路或三路推进入液滴发生装置(2)中；液滴发生装置(2)的出口与刚性热循环模块(8)上的热刚性流道(9)入口相连接，同时热循环温度控制器(15)对刚性流道(9)表面温度进行控制；液滴在刚性热循环模块(8)经过热循环后进入荧光检测控制器(4)，荧光检测控制器(4)对已经通过热循环后的液滴进行实时在线荧光检测。在一些实施方案中，试剂通过反应试剂推进器(6)以及油相推进器(7)还可以分三路、两路、一路或者裂变方式推进入液滴发生装置(2)中。在一些实施方案中，还可以包括自动进样系统，连接于所述动力装置的前端，以实现自动化控制进样。上述的刚性热循环模块(8)主要由刚性流道(9)，刚性圆柱体(11)，圆柱形加热装置孔槽(12)以及热电偶安置孔槽(13)，其中刚性流道(9)是一个呈8字形均匀的缠绕于具有两个不同温度区的刚性圆柱体(11)上，液滴在高导热刚性流道(9)两个温度区间来回稳定流动，同时刚性圆柱体(11)中间部位有安置圆柱形加热装置的孔槽，刚性圆柱体(11)端部紧贴有一热电偶传感器用于检测导热部件温度。在一些实施方案中，所述刚性圆柱体(11)为一个、两个或者三个，以形成相应数量的温度区域；该液滴PCR反应模组(3)的温度可调，可以是上述的一个、两个或三个刚性圆柱体(11)形成一个、两个或者三个温度区域。在一些实施方案中，所述液滴PCR反应模组(3)为绕管式或者芯片式PCR扩增仪。扩增部分可以为平板式(或者称为芯片式)，也可以是绕管式布置，即可以在管线中进行扩增。上述的热循环温度控制器(15)包括热电偶传感器(14)，PC客户端软件模块(16)，单片机(17)，控制电路(18)，DC电源(19)以及(安捷伦)数据采集仪器(20)。其中，热电偶传感器(14)与刚性热循环模块中的刚性圆柱体(11)热接触，实时返回温度数据给(安捷伦)数据采集仪器(20)，(安捷伦)数据采集仪器通过TCP/IP接口(或者GPIB接口)将采集到的温度数据上传到PC端，被PC客户端软件模块(16)收集处理，通过PID逻辑计算得出需要发送给单片机(17)的程控信号。PC客户端软件同时通过可编程仪器标准指令(SCPI)控制(安捷伦)仪器的数据采集参数(采样时间，采样模式，采样开始和结束)。由PC客户端软件计算得到的控制信号经由USB接口传送到单片机(17)，单片机按照程控信号的指令调节PWM输出口的占空比，从而控制晶体管(10)的开关，进而调节DC电源(19)的输出功率，而功率的改变引起刚性热循环模块的温度变化，这样完成一个温度控制循环过程。上述动力装置(1)包括反应试剂推进器(6)以及油相推进器(7)。通过反应试剂推进器(6)以及油相推进器(7)将试剂分三路推进入液滴发生装置(2)中，在液滴发生装置中产生大量油包反应试剂纳升级液滴。通过反应试剂推进器(6)以及油相推进器(7)来调节液滴发成装置(2)的进出口流量来影响流道内压力差，进而控制液滴生成速度和液滴大小。上述荧光检测控制器(4)组成部分包括进样针(24)，荧光检测器(25)(guavaeasyCyte5，MerckMillipore，美国)以及荧光数据收集分析软件(26)。刚性流道(9)末端与进样针(24)进行对接，接入荧光检测器，而后经过数据收集分析软件进行数据处理。本专利技术的工作原理是：对样品进行稀释后，通过动力装置以及液滴发生器生成部分包含样品的液滴，通过热循环控制装置，使得包含样品液滴性状改变，从而改变被测样本的受激发光的强度，通过末端光学部件对包含样品液滴进行激发后，计算机统计检测到的发光强度，并经过一定的数据处理获取最终获取样品具有的生物信息如附图6所示。本专利技术与现有技术相比的有益效果如下：(1)本专利技术与现有数字PCR仪器的主要区别在于整个系统形成以前端液滴生成，PCR反应热循环以及末端液滴荧光实时在线检测的一体化设计，实现扩增与检测的连续操作，能够有效减小现有分体式多步骤操作带来样品污染以及液滴融合等问题。(2)本专利技术采用了刚性管道，得益于刚性流道为具有非弹性壁面能够有效抑制液滴在热循环过程，由于管道变形导致管内水力条件变化而造成液滴破裂与融合。同时由于具有高热传导系数(16W/M-K.20℃下测量)，相比于常规采用的聚四氟乙烯管(0.27W/M-K.20℃下测量)导热效率有很大的提升。(3)本专利技术采用了末端荧光检测，在传统离线的检测有三点缺陷；由于含有目标模板的液滴其密度比作为连续相的矿物油密度要大，随着检测时间的推移，液滴就会顺着重力的方向往下沉降，这样经过一定时间后，液滴将完全沉积在检测管底端；传统荧光检测仪器中的内部结构设置中，为保护进样针，特意让进样针针端与样品管底端之间保留了一段距离，以免其不小心触碰到管底，造成损坏。在这种情况下，当检测进行到一定时间后，流式细胞仪便会因为进样针抽取不到沉降在样品管底部大量的液滴而导致无法正常检测出荧光信号；由于采用油包试剂模式，故在一定时间内液滴的体积远远比油的体积小的多，所以单个样品管内能收集到的液滴十分有限，这样就需要连续收集多管，就会造成实验效率降低。本专利技术得益于进样针的改造，用内径为200um的玻璃毛细管替代流式细胞仪自带的进样针，新进样针能直接与扩增系统相连，使得仪器能对微液滴进行实时连续的高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一体式刚性流道液滴数字PCR系统，其特征在于包括：液滴发生装置(2)、液滴PCR反应模组(3)、荧光检测控制器(4)、液滴PCR反应模组(3)包括刚性热循环模块(8)和热循环温度控制器(15)；试剂分两路或三路推进入液滴发生装置(2)中；液滴发生装置(2)的出口与刚性热循环模块(8)上的刚性流道(9)入口相连接，同时热循环温度控制器(15)对刚性流道(9)温度进行控制；液滴在刚性热循环模块(8)经过热循环后进入荧光检测控制器(4)，荧光检测控制器(4)对已经通过热循环后的液滴进行实时在线荧光检测。

【技术特征摘要】
2016.12.30 CN 201611253007X1.一体式刚性流道液滴数字PCR系统，其特征在于包括：液滴发生装置(2)、液滴PCR反应模组(3)、荧光检测控制器(4)、液滴PCR反应模组(3)包括刚性热循环模块(8)和热循环温度控制器(15)；试剂分两路或三路推进入液滴发生装置(2)中；液滴发生装置(2)的出口与刚性热循环模块(8)上的刚性流道(9)入口相连接，同时热循环温度控制器(15)对刚性流道(9)温度进行控制；液滴在刚性热循环模块(8)经过热循环后进入荧光检测控制器(4)，荧光检测控制器(4)对已经通过热循环后的液滴进行实时在线荧光检测。2.根据权利要求1所述的一体式刚性流道液滴数字PCR系统，其特征在于：所述刚性热循环模块(8)包括刚性流道(9)、刚性圆柱体(11)、圆柱形加热装置孔槽(12)以及热电偶安置孔槽(13)，其中刚性流道(9)是一个呈8字形均匀的缠绕于两个刚性圆柱体(11)上，液滴在刚性流道(9)内部沿着不同温度区的刚性圆柱体(11)上来回稳定流动，同时刚性圆柱体(11)中间部位有圆柱形加热装置孔槽(12)，刚性圆柱体(11)上下表面具有热电偶安置孔槽(13)，用于热循环温度控制器(15)中的热电偶传感器(14)安放，以检测刚性流道(9)的温度。3.根据权利要求1或2所述的一体式刚性流道液滴数字PCR系统，其特征在于：所述热刚性流道(9)为不锈钢毛细管。4.根据权利要求1所述的一体式刚性流道液滴数字PCR系统，其特征在于：所述热循环温度控制器(15)包括晶体管(10)、热电偶传感器(14)、PC客户端软件模块(16)、单片机(17)、控制电路(18)、DC电源(19)和数据采集仪器(20)；其中，热电偶传感器(14)与刚性热循环模块(8)中的刚性圆柱体(11)热接触，实时返回温度数据给数据采集仪器(20)，数据采集仪器(20)通过TCP/IP接口或者GPIB接口将采集到的温度数据上传到PC端，被PC客户端软件模块(16)收集处理，通过PID逻辑计算得出需要发送给单片机(17)的程控信号，PC客户端软件同时通过可编程仪器标准指令(SCPI)控制安捷伦仪器的数据采集参数，所述参数包括采样时间、采样模式、采样开始和结束，由PC客户端软件模块(16)计算得到的控制信号经由USB接口传送到单片机(17)，单片机按照程控信号的指令调节PWM输出口的占空比，从而控制晶体管(10)的开关，进而调节DC电源的输出功率。5.根据权利要求1所述的一体式刚性流道液滴数字PCR系统，其特征在于：所述进样针(24)安置在荧光检测器(25)内部，反应后液滴通过进样针(24)经过荧光检测窗口进行实时荧光检测，而后经过荧光数据收集分析软件(26)对荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昭锋，陈进宇，王进军，方晓娜，何立群，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34