一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒，其特征在于：该技术涉及一种应用大规模平行测序平台NGS技术检测心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒。本发明专利技术的主要特征在于：A.独特设计并制备捕获探针，针对基因ACTC1、ACTN2、ANKRD1、CALR3、CASQ2、CAV3、CSRP3、FHL1、JPH2、LDB3、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、MYPN、NEXN、PLN、PRKAG2、SLC25A4、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TRIM63、TTN、VCL、GLA、TTR、LAMP2、FLNC全部外显子片段；B.设计独特带有标签序列的接头；C.通用引物对探针序列进行PCR扩增；D.设计独特的混合后目的片段的捕获操作。

A kit for differential diagnosis of cardiac hypertrophy gene

The present invention discloses a kit for differential diagnosis of cardiac hypertrophy gene, which is characterized by the application of a kit for the detection of gene differential diagnosis of myocardial hypertrophy by the application of large-scale parallel sequencing platform NGS technology. The main features of the invention are as follows: A. unique design and preparation of capture probes, aiming at gene ACTC1, ACTN2, ANKRD1, CALR3, CASQ2, CAV3, CSRP3, FHL1, JPH2, LDB3, MYBPC3, formulated, formulated, formulated, formulated, formulated, respected, formulated, respected, respected, respected, TTN, VCL, GLA, TTR, LAMP2, FLNC all exons fragments; B. designed a unique label with a sequence of joints; C. universal primers for the probe sequence of PCR amplification; D. designed for a unique mixture of the capture of the target fragment.

【技术实现步骤摘要】
一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种心肌肥厚基因突变的体外诊断试剂盒，是一种应用于新一代测序平台NGS技术的一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒。
技术介绍
心肌肥厚(Myocardialhypertrophy，MH)是多种心血管疾病的共同的病理过程，如心脏瓣膜病、心肌病、高血压等，它是心肌组织为了应付心脏负荷增加所做的一种代偿性反应，在MH的过程中，心肌细胞的蛋白质合成增加、体积增大、心肌细胞纤维化及间质成分增加，是心血管疾病发病的独立危险因素之一。MH可分为病理性肥厚与生理性肥厚，生理性肥厚是指妊娠、体育锻炼等所致的心肌肥厚，但这种类型通常是可逆的；病理性肥厚是指存在心肌病、冠心病、高血压以及结构性心脏病(如心脏瓣膜病)等疾病时，心脏对长期容量负荷过度或压力所出现的心肌肥厚代偿反应，这种肥厚多不可逆。长期的病理性心肌肥厚可引起心脏收缩和舒张功能不全，最终导致心衰、心律失常、心肌缺血甚至猝死等风险。心肌肥厚的病理表现主要为：心肌细胞肥大、与无序的核相互卷曲，心肌结构紊乱，局限性或弥散性的间质纤维化，胶原骨架增厚以及无序，心肌内可出现小血管壁增厚等。心肌肥厚临床常见，病情进展存在的风险较大，因此了解心肌肥厚的发病机制和对致病因素的确诊对患者的病情有着至关重要的作用。目前，Sanger测序作为传统的测序技术，一次反应只能对一段碱基序列进行测定，虽然精准但是效率低，单核苷酸测序成本高。而针对具有遗传异质性的复杂疾病的研究，通常需要对数个甚至数十个基因的全部编码区域进行测序以寻找有价值的突变信息，Sanger测序法不能满足测序的要求。近年，大规模DNA平行测序平台(massivelyparallelDNAsequencingplatform)已经发展为主流的基因测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一、千分之一，而且检测的稳定性和准确性已经大大提高，目前市场上的主要技术平台已经能够达到99.99％的准确性。特别是这项技术的高通量特性，使得以前花费半年或者一年以上时间进行的复杂遗传疾病的基因检测成为可能。本专利技术可以同时检测几十个甚至上百个病人的检测，非常使用于地区性的检测中心使用。目前NGS技术将广泛应用，使研究人员对疾病与遗传物质关系的研究达到了新的高度。NGS技术诊断的优势在于：1)方便，安全，快捷：仅抽取2-4毫升血；2)任何时间都可以检查；3)不限制饮食，服药，任何身体状况都可以检测；4)相比反复，多项传统检查，更为经济；5)发病前，疾病极早期诊断的唯一方式；6)源头确诊，一次检测，终身受益本专利技术是在现有的NGS技术之上，通过自主设计捕获全部目的基因的探针，并对探针和反应体系的不断优化，不仅可以一次性检测全部心肌肥厚的致病基因，更提高了检测的准确度，并极大的降低了测序的成本，使之广泛用于临床成为可能。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种心肌肥厚相关基因突变的目标捕获再测序的试剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本低。为实现上述目的，本专利技术采用捕获目的ACTC1、ACTN2、ANKRD1、CALR3、CASQ2、CAV3、CSRP3、FHL1、JPH2、LDB3、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、MYPN、NEXN、PLN、PRKAG2、SLC25A4、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TRIM63、TTN、VCL、GLA、TTR、LAMP2、FLNC基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。本专利技术采用的技术方案是：一种新的目标捕获再测序方法，包括以下步骤：A.设计并制备用于捕获心肌肥厚相关基因突变的探针。并将这些探针结合在磁珠、薄膜或者玻片上。B.将待测基因DNA样品分别片段化至200-400bp，然后将末端补平，加入的ATP使片段两端引入粘性末端。C.分别加入Illumina公司DNASamplePrepKit中设计好的一端带有标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与的一对接头连接，形成新的片段。D.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对Illumina公司IndexKit-PCRprimers通用引物，对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR扩增反应；E.将步骤d所得全部样品的PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交，然后经过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。F.将待测片段通过illumina公司Miseq测序仪的标准方案进行大规模平行测序。G.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。为实现上述技术方案，步骤A所述的捕获探针是脱氧核糖核酸(DNA)，或是核糖核酸(RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针为120bp的与目标互补的片段组成。探针可以是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。链霉素磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、橡胶磁，但不仅限于这些材质。其中，步骤A所述的捕获探针，包括覆盖以下基因ACTC1、ACTN2、ANKRD1、CALR3、CASQ2、CAV3、CSRP3、FHL1、JPH2、LDB3、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、MYPN、NEXN、PLN、PRKAG2、SLC25A4、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TRIM63、TTN、VCL、GLA、TTR、LAMP2、FLNC全部编码外显子片段和两端50bp范围内的序列。这些探针以叠瓦式设计，片段长度为50bp-180bp，最优为75bp；片段长度为60bp-200bp，最优为80bp；片段长度为65bp-220bp，最优为85bp；片段长度为70bp-240bp，最优为90bp；探针之间重叠部分为5-20bp，最优为8bp；目标区碱基的探针覆盖度为1×至10×，最优为3×。本专利技术的主要优点在于：1.本专利技术可以在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部心肌肥厚相关基因的检测；全部序列直接测出，准确率可以达到99.99％。2.本专利技术的试剂盒可以一次完成1-48个样品的平行捕获，提高了捕获效率，极大地降低了样品准备的成本。3.本专利技术的试剂盒可以一次完成1-1152个样品的全部致心肌肥厚相关基因，近4000条序列的平行检测，充分利用设备的高通量特性，极大降低了每个样品的测序成本。4.本专利技术的试剂盒可以一次反应同时分辨错义、插入和缺失突变。大大增加了临床检出率和准确性。5.本专利技术的检测方法步骤简单，减少重复操作的环节，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定引物，提高了检测准确率和稳定性。6.本专利技术所提供的检测方法所需时间大大少于sanger法的测序技术.7.实例：在完成同样的检测量(100人份的检测量)，sanger法需要2个人工同时工作一周。我们的方法只需要一个人在一天内完成全部的检测量。8.检测的准确度大大优于基因芯片技术，更符合临床检测要求。基因芯片只能检测碱基错义突变，而插入和缺失突变无法同时检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒，其包括：捕获目的ACTC1、ACTN2、ANKRD1、CALR3、CASQ2、CAV3、CSRP3、FHL1、JPH2、LDB3、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、MYPN、NEXN、PLN、PRKAG2、SLC25A4、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TRIM63、TTN、VCL、GLA、TTR、LAMP2、FLNC基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。

【技术特征摘要】
1.一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒，其包括：捕获目的ACTC1、ACTN2、ANKRD1、CALR3、CASQ2、CAV3、CSRP3、FHL1、JPH2、LDB3、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、MYPN、NEXN、PLN、PRKAG2、SLC25A4、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TRIM63、TTN、VCL、GLA、TTR、LAMP2、FLNC基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。2.根据权利要求1所述“一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒”，全部探针在3’采用生物素修饰。3.根据权利要求1所述“一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒”这种探针是寡聚核糖核酸(RNA)，或寡聚脱氧核糖核酸(DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以包括生物素、荧光或者同位素等修饰后的DNA或者RNA。4.根据权利要求1所述“一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒”的探针针对目标区域以高密度叠瓦式设计，探针序列与ACTC1、ACTN2、ANKRD1、CA...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋雷，王继征，惠汝太，邹玉宝，张禅那，
申请(专利权)人：中国医学科学院阜外医院，
类型：发明
国别省市：北京,11