本发明专利技术涉及兽医病原微生物检测技术领域，公开了一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法。本发明专利技术所述试剂由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物、在SEQ ID NO:3所示核苷酸序列上修饰有荧光基团1和淬灭基团的狂犬病毒疫苗株探针和在SEQ ID NO:4所示核苷酸序列上修饰有荧光基团2和淬灭基团的狂犬病毒野生型毒株探针组成。本发明专利技术提供了一组具备较高特异性和灵敏度的引物和探针试剂，通过所述试剂实现了准确鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的目的，弥补了现有一般病毒分离，血清学试验，RT‑PCR等方法较难区分野毒株与疫苗株的缺陷，可全面应用于狂犬病毒疫苗的安全性评价以及临床诊断中。
【技术实现步骤摘要】
一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法
本专利技术涉及兽医病原微生物检测
，具体涉及一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法。
技术介绍
狂犬病毒(Rabiesvirus,RV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA，是引起狂犬病的病原体。狂犬病毒G蛋白是唯一可诱导机体产生中和抗体进行体液免疫的病毒结构蛋白，以前的研究已经确定G蛋白几个空间表位和线性表位。G基因编码524个氨基酸(AA)，在肽链的氨基端，前19个残基为信号肽，在成熟过程中，信号肽被切除，变为含505个AA的成熟G蛋白。它分为三个区域：膜外区，即抗原区(1～439AA)，位于病毒颗粒的表面；跨膜区(440～461AA)，由23个AA组成连续的疏水区域，与G蛋白在病毒的脂双层膜上的固定有关；膜内区(462～505AA)，由44个AA构成的羧基末端，位于病毒包膜的内表面，提供M和N相互作用的位点。膜外区是G蛋白抗原性的主要区域，在该区域内，至少已确定有6个抗原表位，其中抗原位点Ⅱ和III最重要，抗原位点Ⅱ保守，由第34～42和第198～200位AA残基通过二硫键连接形成，它们受147和184位点AA残基的影响；抗原位点III也是由两个非连续区域构成，即330～338和357AA残基；表位I由23l位AA残基参与；表位Ⅳ由264位AA残基参与；表位V由254～275AA残基组成，是一个线性表位，在目前所测序的毒株中均保守，LHKFRSDE是其核心序列，L被P、Q或V及D被更小的氨基酸A、G取代后，可明显增强与单抗的结合效果，说明D有空间位阻效应。抗原位点a(minorsite“a”)位于342～343位AA残基。在抗原位点III最关键和最易变化的AA在第333,336,338和357位，在抗原位点II是第198位AA上，它们不仅是病毒的中和抗原决定簇，是病毒中和抗体的主要结合部位，而且与病毒的感染和毒力直接相关，其中，第333位的精氨酸往往随着固定毒株致病性的失去而被异亮氨酸、天冬氨酸或谷氨酸取代。在1990年，Dietzschold等人在ERA株上的G蛋白244～281位AA残基位点发现一个线性表位。然而，在1995年，Ni等人在几个实验室毒株发现，位于249和268位AA残基位点之间的序列构成一个线性表位，而且263位点的Phe是识别RG719单克隆抗体的必需AA残基。因此，狂犬病毒G蛋白第333位精氨酸往往随着野毒株致病性的失去而被异亮氨酸、天冬氨酸或谷氨酸取代。目前检测狂犬病毒的实验室方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体方法(FAT)、快速荧光抑制灶技术(RFFIT)、反转录－聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等。但是这些方法不能区分野生型毒株和疫苗株，尤其缺乏对狂犬病毒疫苗株的鉴定方法，对于疫苗的安全性评价以及临床诊断等方面的应用存在不足，致使狂犬病毒疫苗使用存在一定的风险。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂，使得所述试剂能够准确鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株，并具备较高的特异性和灵敏度；本专利技术的另外一个目的在于提供上述试剂在鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株以及在制备鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂盒中的应用；本专利技术的另外一个目的在于提供基于上述试剂鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂，由SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物、在SEQIDNO:3所示核苷酸序列上修饰有荧光基团1和淬灭基团的狂犬病毒疫苗株探针和在SEQIDNO:4所示核苷酸序列上修饰有荧光基团2和淬灭基团的狂犬病毒野生型毒株探针组成。作为优选，所述荧光基团1和荧光基团2选自HEX和FAM，且互不相同；所述淬灭基团选自MGB。在本专利技术具体实施方式中，所述试剂中引物和探针序列如下：上游引物TGACCACMAAGTCCGTGAGTTT；下游引物AGCATCAGCCTCCATCAAGGT；疫苗株探针5’HEX-GGAAAAGCATATACCATATTC–MGB3’；野生型毒株探针5’FAM-GGAAAGGCGTATACCATATT-MGB3’；用本专利技术所述试剂中的引物和探针进行快速检测，以国内分离的狂犬病毒CVS-11疫苗株、JX-08-45疫苗株和BD06野毒株核酸RNA为模板均可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如犬瘟热病毒核酸、犬冠状病毒核酸、犬轮状病毒核酸和犬细小病毒核酸和健康犬咽拭子总核酸为模板进行RPA反应均没有扩增曲线。同时，检测结果表明FAM通道仅对狂犬病毒野毒株进行扩增，Hex通道仅对狂犬病毒疫苗株进行扩增。表明本专利技术检测试剂能特异性扩增狂犬病毒并且能区分疫苗株与野毒株，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。此外，在灵敏度试验中，检测结果表明本专利技术所述试剂具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度。试验结果表明，本专利技术所述试剂对于狂犬病毒野毒株和疫苗株的检测具有高度的灵敏性。而在实际临床样本检测中，本专利技术能够有效区分Rabigen狂犬病灭活疫苗株、宠必威犬猫狂犬病灭活疫苗株、Nobivac犬猫狂犬病灭活疫苗株和病犬组织以及健康犬组织中的狂犬病毒类型，而标准《SN/T4087-2014狂犬病检疫技术规范》虽能检测出狂犬病毒，但不能分型，这些结果表明本专利技术能够区分临床上的未知野毒株和疫苗株，并非仅限于BD06野毒株与所列举的疫苗株。基于上述优异的技术效果，本专利技术提出了所述试剂在鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株和/或在制备鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂盒中的应用。其中，在本专利技术具体实施方式中，所述狂犬病毒疫苗株为狂犬病毒CVS-11疫苗株、狂犬病毒JX-08-45疫苗株、Rabigen狂犬病灭活疫苗株、宠必威犬猫狂犬病灭活疫苗株或Nobivac犬猫狂犬病灭活疫苗株；所述狂犬病毒疫苗株野生型毒株为狂犬病毒BD06野毒株。根据上述应用，本专利技术提供了一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂盒，包括本专利技术所述试剂。为了进一步完善所述试剂盒，其还可以包括狂犬病毒RNA提取试剂、RT-PCR反应试剂和实时荧光定量PCR反应试剂。所述狂犬病毒RNA提取试剂可包括本领域常规用于提取狂犬病毒株RNA的试剂的一种或多种，在本专利技术具体实施方式中，本专利技术狂犬病毒RNA提取试剂采用QIAGEN公司的供应MiniKit中的各种试剂。所述RT-PCR反应试剂和实时荧光定量PCR反应试剂可包括本领域常规RT-PCR以及实时荧光定量PCR反应体系中的试剂的一种或多种；在本专利技术具体实施方式中，采用OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit(PerfectRealTime)(TaKaRa)试剂盒中的2×OneStepRT-PCRBufferⅢ、TaKaRaExTaqHS(5U/μl)、PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ和DEPCH2O等，一步完成逆转录反应和实时荧光定量PCR。本专利技术还根据应用提供了一种鉴定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂，其特征在于，由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物、在SEQ ID NO:3所示核苷酸序列上修饰有荧光基团1和淬灭基团的狂犬病毒疫苗株探针和在SEQ ID NO:4所示核苷酸序列上修饰有荧光基团2和淬灭基团的狂犬病毒野生型毒株探针组成。
【技术特征摘要】
1.一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂，其特征在于，由SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物、在SEQIDNO:3所示核苷酸序列上修饰有荧光基团1和淬灭基团的狂犬病毒疫苗株探针和在SEQIDNO:4所示核苷酸序列上修饰有荧光基团2和淬灭基团的狂犬病毒野生型毒株探针组成。2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，所述荧光基团1和荧光基团2选自HEX和FAM，且互不相同。3.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，所述淬灭基团选自MGB。4.权利要求1-3任意一项所述试剂在鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株和/或在制备鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂盒中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述狂犬病毒疫苗株为狂犬病毒CVS-11疫苗株、狂犬病毒JX-08-45疫苗株、Rabigen狂犬病灭活疫苗株、宠必威犬猫狂犬病灭活疫苗株或Nobivac犬猫狂犬病灭活疫苗株。6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述狂犬病毒疫苗株野生型毒株为狂犬病毒BD0...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭理琦，郑晓聪，秦智锋，李汶松，蔡良语，卢奕良，王津津，孙洁，林彦星，马岚，钟松清，刘建利，刘荭，兰文升，
申请(专利权)人：深圳市福田区动物防疫监督所，深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44
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