原位杂交检测长链非编码RNA PVT1表达量的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种原位杂交检测长链非编码RNA PVT1表达量的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用。根据该基因序列设计并合成了原位杂交寡核苷酸探针，在94例有临床随访资料的鼻咽癌石蜡存档标本中，通过原位杂交(in situ hybridization)的方法检测了PVT1的表达水平，发现PVT1在63.8％的鼻咽癌组织中(60/94例)有高表达，而仅在18.2％(33例正常组织样本中的6例)的正常鼻咽上皮组织中有高表达，表明针对该lncRNA的检测制剂可以用于鼻咽癌的辅助诊断。

【技术实现步骤摘要】
原位杂交检测长链非编码RNAPVT1表达量的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及原位杂交检测长链非编码RNAPVT1的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂上的应用方法。
技术介绍
人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(TheEncyclopediaofDNAElementsProject,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中lncRNA序列的比例也相应地增大，提示lncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着lncRNA不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现lncRNA广泛而活跃地参与到生命活动不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿与热点。LncRNA可作为功能蛋白质的信号(signal)、诱导(guide)、诱饵(decoy)或支架(scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的是，lncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一起。因此，深入研究lncRNA的功能，揭示由lncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差，放射治疗是目前鼻咽癌临床上主要的治疗方案，部分鼻咽癌患者由于癌细胞存在放射抵抗(Radioresistance)，也就是对放射治疗不敏感，放射线不能完全杀死肿瘤细胞，残存的肿瘤细胞最终复发，转移，导致患者的死亡。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在鼻咽癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用，同时lncRNA也可能参与了鼻咽癌细胞反射敏感性的调控。最近我们利用lncRNA芯片，构建了鼻咽癌活检组织及正常对照样品中lncRNA的表达谱，从中筛选了一些在鼻咽癌中差异表达的lncRNAs，经扩大样本实时荧光定量PCR验证，证实lncRNAPVT1在鼻咽癌中表达显著上调，表明针对该lncRNA的检测制剂可以用于鼻咽癌的辅助诊断。随后，我们进一步增加样本，在94例有临床随访资料的鼻咽癌石蜡存档标本中，通过原位杂交(insituhybridization)的方法检测了PVT1的表达水平，发现PVT1表达高的患者更容易发生放疗抵抗，其生存时间短于该lncRNA表达低的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的疗效预测和预后判断。我们通过设计并合成靶向PVT1的短发夹RNA(short-hairpinRNA,shRNAs)序列，构建了靶向PVT1的RNA干扰载体，转染到鼻咽癌细胞株中，并证实了靶向干扰PVT1的表达可明显增强鼻咽癌细胞的放疗敏感性。将PVT1的RNA干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护PVT1的RNA干扰载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。因此针对该lncRNA的干扰制剂靶向抑制该lncRNA在鼻咽癌细胞中的表达可以诱导鼻咽癌细胞对放疗更加敏感，从而可以作为新型放疗增敏剂，用于鼻咽癌的辅助治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供原位杂交检测长链非编码RNAPVT1的表达量的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用，该长链非编码RNAPVT1的序列如SEQNO:1所示。用于原位杂交检测PVT1表达的寡核苷酸探针：PVT1探针1：5’-GGTCGGACTAGAAAACCGGTCTTCCTCTAATTTT-3’；PVT1探针2：5’-GAGACTGTAAAAACTTCTCAGGTCTTAGGA-3’；PVT1探针3：5’-CTCATAAAACTCTAACCTCTTAATTCTCGGTCAG-3’。阳性对照探针序列如下：GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'；GAPDH探针2：5'-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'；GAPDH探针3：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。本专利技术根据该基因序列设计并合成了原位杂交寡核苷酸探针，在94例有临床随访资料的鼻咽癌石蜡存档标本中，通过原位杂交(insituhybridization)的方法检测了PVT1的表达水平，发现PVT1在63.8％的鼻咽癌组织中(60/94例)有高表达，而仅在18.2％(33例正常组织样本中的6例)的正常鼻咽上皮组织中有高表达，表明针对该lncRNA的检测制剂可以用于鼻咽癌的辅助诊断，具有显著的临床医学意义。附图说明图1为实时荧光定量PCR技术验证lncRNAPVT1在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中的表达情况，PVT1在鼻咽癌(T)中的表达比正常鼻咽上皮(N)中显著提高。图2为原位杂交检测PVT1在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况，正常鼻咽上皮(NPE)中表达水平较低(仅在6例正常鼻咽上皮组织中检测到有高表达，其余27例中检测表达低或不表达)，而在63.8％的鼻咽癌(94例鼻咽癌组织中的60例)中检测到有PVT1的高表达；P<0.001。图3为鼻咽癌中PVT1的表达与鼻咽癌患者放疗敏感性相关，在92例有临床随访资料的鼻咽癌患者中，44例为放疗抵抗(Radioresistant，即对放疗不够敏感)，48例为放疗敏感(Radiosensitive)，在放疗敏感组60.4％的患者(29例)鼻咽癌组织中PVT1低表达，而在放疗抵抗组仅11.4％(5例)中检测到有PVT1的高表达；P<0.001。图4为鼻咽癌中PVT1的表达与鼻咽癌患者预后的关系，鼻咽癌中PVT1的高表达与鼻咽癌患者的不良预后相关，即PVT1高表达(high)的患者总的生存时间(Over-allsurvival，左)和无复发生存时间(Relapse-freesruvival，右)要明显低于PVT1低表达或不表达的患者(Low)。图5为在鼻咽癌细胞中导入PVT1的干扰载体，可显著抑制PVT1在鼻咽癌细胞中的表达，在鼻咽癌细胞系CNE2和5-8F中导入靶向PVT1的干扰载体(siPVT1)后，实时荧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中PVT1的表达情况，PVT1的表达均受到明显的抑制。阴性对照(NC)为scramble干扰载体。图6为在鼻咽癌细胞中导入PVT1的干扰载体抑制PVT1表达后，细胞对放射治疗更加敏感，鼻咽癌细胞系CNE2和5-8F中导入靶向PVT1的干扰载体(siPVT1)抑制PVT1的表达后，细胞分别接受0，2，4，6，8Gy剂量的放射线照射，随后细胞继续培养12天，克隆集本文档来自技高网...

【技术保护点】
原位杂交检测长链非编码RNA PVT1表达量的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用，该长链非编码RNA PVT1的序列如SEQ NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.原位杂交检测长链非编码RNAPVT1表达量的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用，该长链非编码RNAPVT1的序列如SEQNO:1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于原位杂交检测PVT1表达的寡核苷酸探针：PVT1探针1：5’-GGTCGGACTAGAAAACCGGTCTTCCTCTAATTTT-3’；PVT1探针2：5’-GAGACTGTAAAAACTTCTCAGGTCTTAGGA-3’；PVT1探针3：...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭灿，曾朝阳，熊炜，李桂源，何奕，李小玲，熊芳，李夏雨，武迎芬，范春梅，唐乐，赵瑾，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43