白菜型油菜DGAT1基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了白菜型油菜DGAT1基因及其应用，属于基因工程领域。白菜型油菜DGAT1基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示。该基因来源于白菜型油菜(Brassica rapa)(芥头2号)，编码二酰甘油酰基转移酶，是生物体内TAG合成过程中的关键酶。利用本发明专利技术的白菜型油菜DGAT1基因转化酵母细胞能大幅提高酵母细胞的总油脂含量，可将该基因应用于生物油脂制备领域，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
白菜型油菜DGAT1基因及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及白菜型油菜DGAT1基因、其编码蛋白及应用。
技术介绍
三酰甘油(TAG)是植物贮藏脂类的主要贮存形式，它广泛分布于植物的种子、花粉、果实和叶片等器官中，主要参与细胞膜脂构建、能量代谢、逆境反应、种子萌发和花粉发育等众多生命活动。随着对油脂合成途径研究的深入，发现植物主要有2条TAG生物合成途径。其一为Kennedy途径，是植物组织中油脂生物合成的主要途径。在该途径中二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerolacyltransferase,DGAT)是控制TAG合成的最后一步反应的限速酶，它催化酰基链从脂酰基辅酶A转移到sn-1,2-二脂酰甘油(DAG)的sn-3位上的反应，从而形成TAG。另一合成途径是由磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)控制的以磷脂作为酰基供体的TAG的合成。DGAT是一种微粒体酶，该酶的活性与脂肪代谢及脂类在组织中的沉积有密切关系，它能够催化二酰甘油与酰基辅酶A的共价结合，从而形成甘油三酯(TAG)；而DGAT是三酰甘油生物合成途径中关键限速酶。到目前为止，根据其序列相似度、基因定位和基因结构等方面的差异可分为：DGAT1、DGAT2和DGAT3。DGAT1属于MBOAT酰基转移酶超基因家族中的酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶家族(acy1CoA:cholesterolacyltransferase.ACAT)，是一种特殊类型的DGAT酶；而DGAT2和最初克隆到的DGAT在氨基酸序列上存在差异，属于DGAT2超基因家族，在大多数动植物体内跟DGAT1是直系同源，DGAT1和DGAT2蛋白主要结合在内质网膜上，二者相似度很高，而DGAT3只在发育中的花生子叶中发现的新类型，定位于细胞质内，由于其与DGAT1和DGAT2的相似度极低，因将其命名为DGAT3。DGAT广泛存在于叶片、花瓣、果实、花粉囊以及发育的种子等不同器官中,尤其在发育的种子和花瓣中其含量和活性较高。自1999年以来，研究人员在拟南芥、油菜、蓖麻、烟草、大豆等其他植物均得到了DGAT基因。研究表明DGAT1是属于酰基辅酶A转移酶活性家族的一类酶，除了二酰基甘油外，它还能利用不同的受体。例如，MmDGAT1也拥有酰基辅酶A：视黄醇酰基转移酶(retinolacyltransferaseARAT)的活性，以及拟南芥中酰基辅酶A：脂肪族醇酰基转移酶(fattyalcoholacyltransferase)又叫蜡酯合成酶(waxestersynthaseWSD1)，在体外也表现出DGAT的活性。近年来，对植物油脂的广泛需求极大的促进了DGAT相关基因的研究，尤其是在利用基因工程方法改良优质品质方面获得了较大的发展。2008年，Zheng通过对高油玉米DGAT1的研究发现，在DGAT1-2蛋白的F469位点处的一个苯丙氨酸的插入是提高油含量和油酸含量的重要决定因素，阐明了油含量以及组成差异的分子基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供白菜型油菜DGAT1及其应用。本专利技术首先提供白菜型油菜DGAT1蛋白，其具有：1)如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本专利技术提供了编码白菜型油菜DGAT1蛋白的基因，其具有：1)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或2)SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本专利技术提供了含有上述编码白菜型油菜DGAT1蛋白的基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。本专利技术提供了上述白菜型油菜DGAT1蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在提高细胞中总油脂含量中的应用。所述细胞为酵母细胞或植物细胞。所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。所述酿酒酵母为酿酒酵母H1246。本专利技术提供了上述白菜型油菜DGAT1蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。所述的转基因植物为含油量高的转基因植物。所述的植物为油类作物或小球藻。所述油类作物为油菜、拟南芥、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻或花生。本专利技术提供了上述白菜型油菜DGAT1蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在植物种质资源改良中的应用。本专利技术提供了上述白菜型油菜DGAT1蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在生产食用油中的应用。本专利技术提供了上述白菜型油菜DGAT1蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在生产生物柴油中的应用。本专利技术克隆了白菜型油菜(Brassicarapa)(芥头2号)的DGAT1基因BrDGAT1(在基因组数据中的编号为Bra036722)，将其转入酿酒酵母突变体H1246后，可大幅度提高酵母总油脂的含量。本专利技术选择突变型酵母在对BrDGAT1基因进行功能验证的同时还发现了其对油脂合成的显著作用。在酵母中研究表明，BrDGAT1基因转酵母株与对照组(转pYEST02-GFP空载)相比，总油脂含量大幅提高3倍以上。在拟南芥异源表达中，可以提高其种子中总脂肪含量为5.23-12.86％。附图说明图1为BrDGAT1酵母表达载体构建图谱，Bra036722即为BrDGAT1。图2为尼罗红染色法测定酵母中TAG含量分析图，在共聚焦显微镜观察，GFP为转空载的对照，BrDGAT1为转BrDGAT1基因的酵母，箭头所指为油体。图3为TLC法测定的酵母总脂肪酸含量分析图，GFP为对照；BrDGAT1为转BrDGAT1基因的酵母；TAG，为油脂的阳性对照。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例中使用的酿酒酵母突变体H1246来自(购自ScanBiLtd公司)，本实施例的白菜型油菜(品种名：芥头2号)来自本实验室保存的种质。实施例1白菜型油菜(芥头2号)BrDGAT1基因cDNA全长的获得取白菜型油菜(芥头2号)的成株新鲜叶片约0.1克，置于液氮中充分研磨。根据QiagenRNeasyMiniKit(Valencia,CA)的说明提取总RNA，进行总RNA提取和纯化。根据TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix(Beijing,China)说明书反转录获得cDNA，并进行RT-PCR(具体操作见TOYOBOReverTraAce-α试剂盒)。cDNA合成的反应组分如下：用RNaseFreeH2O补至总体积为20μL。首先将RNA、引物和RNaseFreeH2O充分混匀后65℃孵育5分钟，再冰浴2分钟，然后再加入其它组分充分混匀后42℃孵育30分钟，85℃反应5秒灭活RT/RIEnzyme和gDNAremover。取适量上述逆转录产物以正向引物(agcaggctttgacttATGGCGGTTTTGGATTCTGGAG)和反向引物(tgggtctagagacttGGACATGGATCCTTTGCGGT)进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性95℃2min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃2min，25个循环；总延伸72℃5min。将上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
白菜型油菜DGAT1蛋白，其特征在于，其具有：1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.白菜型油菜DGAT1蛋白，其特征在于，其具有：1)如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其具有：1)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或2)SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。4.权利要求1所述的白菜型油菜DGAT1蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在提高细胞中总油脂含量中的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡赞民，张新永，宋雷，范成明，陈宇红，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11