突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制制造技术

本发明专利技术公开了突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制，用基因重组技术来表达和纯化正常的Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质。然后采用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance technology，SPR)测定纯化的Nasp蛋白质结合组蛋白H1，H3，H4和H3/H4四聚体的能力。通过比较正常Nasp蛋白质和变异Nasp蛋白质结合组蛋白的能力，可以判断变异的Nasp蛋白质结合组蛋白的能力是否发生改变。在测定蛋白质相互作用方面，SPR方法非常精确、敏感性高。我们将在体外分析突变的Nasp蛋白质结合组蛋白的能力和对细胞增殖的影响；通过新建四个同类系小鼠模型，体内研究突变基因Nasp对SLE发病的促进作用和效应机制。

【技术实现步骤摘要】
突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制
本专利技术涉及基因突变
，具体为突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制。
技术介绍
从狼疮性易感基因亚座Sle2c1rec1中发现只有Nasp基因出现外显子碱基突变，其它蛋白质编码基因的外显子碱基序列正常。值得注意的是突变引起Nasp蛋白质中两个连续氨基酸的改变，即Nasp基因突变导致其蛋白质中第254和255位的氨基酸发生了改变，由缬氨酸亮氨酸序列转换为异亮氨酸苯丙氨酸序列，并且位于该蛋白质的近中心部位的关键功能区内。首先需要解决的问题是该基因突变是否导致Nasp蛋白质功能的变化，比如失去活性，活性的增高或降低等。因为蛋白质是基因功能的最终执行者，回答这个问题是澄清该Nasp基因突变是否是参与自身免疫病的先决条件。因此本项课题的第一个研究目标是用体外实验测定突变基因Nasp的蛋白质功能。为了确认狼疮性小鼠突变基因Nasp在自身免疫病发病中的作用，我们认为还需要解决两方面的问题。首先，虽然在小鼠狼疮性易感基因亚座Sle2c1rec1c中，我们发现只有Nasp基因的外显子发生了碱基突变，造成了该蛋白质内近中心部位连续两个氨基酸的改变。但是，我们不能排除可能存在其它形式的突变基因及其在狼疮性自身免疫病中的作用，例如由于启动子区碱基变异导致基因转录功能的升高或降低，或者由于内含子与外显子剪接部位碱基突变产生了异常的蛋白质异构体。其次，假如突变基因Nasp的确参与自身免疫病的发病，那么它的作用机制是什么，是引起了免疫耐受的破坏或放大自身免疫反应，还是参与了末端器官的炎症反应。因此，回答这些问题是本项课题的第二个研究目标，通过新品系小鼠的创建及其体内实验研究加以实现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制，以解决现有的技术缺陷和不能达到的技术要求。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：用基因重组技术来表达和纯化正常的Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质。然后采用表面等离子共振技术(surfaceplasmonresonancetechnology，SPR)测定纯化的Nasp蛋白质结合组蛋白H1，H3，H4和H3/H4四聚体的能力。通过比较正常Nasp蛋白质和变异Nasp蛋白质结合组蛋白的能力，可以判断变异的Nasp蛋白质结合组蛋白的能力是否发生改变。在测定蛋白质相互作用方面，SPR方法非常精确、敏感性高。用真核细胞表达载体携带正常NaspcDNA和基因突变的NaspcDNA进入小鼠T细胞内并进行高表达Nasp蛋白质，然后测定细胞内DNA量的变化和溴化尿嘧啶(BrdU)掺入水平，来检测细胞增殖反应的程度。通过比较细胞内高表达的正常Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质对细胞增殖影响的差异有无或程度，来检验突变的Nasp蛋白质的功能是否发生了改变。优选的，将狼疮小鼠Nasp基因的突变外显子替代正常B6小鼠的相应外显子，即在B6小鼠的遗传背景上携带狼疮模型小鼠的Nasp突变外显子，产生基因敲入小鼠新品系，称之为B6.ΔNasp品系。将B6.ΔNasp小鼠与B6.lpr小鼠杂交，产生的子代小鼠反复互交，最终获得纯合子的既带有狼疮小鼠的Nasp突变基因又带有lpr基因的小鼠品系，即B6.ΔNasp.lpr小鼠。然后我们将检测B6.ΔNasp.lpr小鼠的淋巴结T细胞表型和肾脏病理。如果B6.ΔNasp.lpr小鼠表现出与B6.Sle2c1rec1c.lpr小鼠相同的免疫病理变化，那么可以确认突变基因Nasp就是模型小鼠系统性红斑狼疮(SLE)发病的致病基因之一。优选的，如果突变基因Nasp与FcγRIIb缺陷功能互补并呈现乘积效应，则B6.ΔNasp.FcγRIIb-/-小鼠应当表现出比B6.FcγRIIb-/-小鼠更加严重的免疫病理变化，提示突变基因Nasp的功能是促进末端器官炎症反应；如果突变基因Nasp与Yaa基因座呈现互补和乘积效应，引起更严重的自身免疫病理改变，则表示突变基因Nasp的功能是打破免疫耐受。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：1.由狼疮性小鼠的Nasp基因突变造成了其蛋白质中近中心部位两个相邻氨基酸的变化是否引起功能性的改变，这将是阐明该Nasp基因突变是否参与自身免疫病的发病或如何发挥作用的重要环节。2.新模型小鼠品系的建立和对它们自身免疫病理学的检测将确认突变基因Nasp是否是狼疮性易感基因亚座Sle2c1rec1c中的致病基因，以及将阐明它在狼疮性自身免疫病发病中的作用机理。本项研究将有助于阐明人类SLE发病的机制，为寻找有效的治疗手段或研制特效药物提供帮助。附图说明图1为专利技术突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制的Sle2c1rec1c易感基因亚座染色体图谱。图2为本专利技术中B6.Sle2.lpr同类系小鼠的异常免疫表型对照图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供一种技术方案：用基因重组技术来表达和纯化正常的Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质。然后采用表面等离子共振技术(surfaceplasmonresonancetechnology，SPR)测定纯化的Nasp蛋白质结合组蛋白H1，H3，H4和H3/H4四聚体的能力。通过比较正常Nasp蛋白质和变异Nasp蛋白质结合组蛋白的能力，可以判断变异的Nasp蛋白质结合组蛋白的能力是否发生改变。在测定蛋白质相互作用方面，SPR方法非常精确、敏感性高。用真核细胞表达载体携带正常NaspcDNA和基因突变的NaspcDNA进入小鼠T细胞内并进行高表达Nasp蛋白质，然后测定细胞内DNA量的变化和溴化尿嘧啶(BrdU)掺入水平，来检测细胞增殖反应的程度。通过比较细胞内高表达的正常Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质对细胞增殖影响的差异有无或程度，来检验突变的Nasp蛋白质的功能是否发生了改变。优选的，将狼疮小鼠Nasp基因的突变外显子替代正常B6小鼠的相应外显子，即在B6小鼠的遗传背景上携带狼疮模型小鼠的Nasp突变外显子，产生基因敲入小鼠新品系，称之为B6.ΔNasp品系。将B6.ΔNasp小鼠与B6.lpr小鼠杂交，产生的子代小鼠反复互交，最终获得纯合子的既带有狼疮小鼠的Nasp突变基因又带有lpr基因的小鼠品系，即B6.ΔNasp.lpr小鼠。然后我们将检测B6.ΔNasp.lpr小鼠的淋巴结T细胞表型和肾脏病理。如果B6.ΔNasp.lpr小鼠表现出与B6.Sle2c1rec1c.lpr小鼠相同的免疫病理变化，那么可以确认突变基因Nasp就是模型小鼠系统性红斑狼疮(SLE)发病的致病基因之一。优选的，如果突变基因Nasp与FcγRIIb缺陷功能互补并呈现乘积效应，则B6.ΔNasp.FcγRIIb-/-小鼠应当表现出比B6.FcγRIIb-/-小鼠更加严重的免疫病理变化，提示突变基因Nasp的功能是促进末端器官炎症反应；如果突本文档来自技高网...

【技术保护点】
突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制，其特征在于：其步骤如下：1)用基因重组技术来表达和纯化正常的Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质。然后采用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance technology，SPR)测定纯化的Nasp蛋白质结合组蛋白H1，H3，H4和H3/H4四聚体的能力。通过比较正常Nasp蛋白质和变异Nasp蛋白质结合组蛋白的能力，可以判断变异的Nasp蛋白质结合组蛋白的能力是否发生改变。在测定蛋白质相互作用方面，SPR方法非常精确、敏感性高。2)用真核细胞表达载体携带正常Nasp cDNA和基因突变的Nasp cDNA进入小鼠T细胞内并进行高表达Nasp蛋白质，然后测定细胞内DNA量的变化和溴化尿嘧啶(BrdU)掺入水平，来检测细胞增殖反应的程度。通过比较细胞内高表达的正常Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质对细胞增殖影响的差异有无或程度，来检验突变的Nasp蛋白质的功能是否发生了改变。

【技术特征摘要】
1.突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制，其特征在于：其步骤如下：1)用基因重组技术来表达和纯化正常的Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质。然后采用表面等离子共振技术(surfaceplasmonresonancetechnology，SPR)测定纯化的Nasp蛋白质结合组蛋白H1，H3，H4和H3/H4四聚体的能力。通过比较正常Nasp蛋白质和变异Nasp蛋白质结合组蛋白的能力，可以判断变异的Nasp蛋白质结合组蛋白的能力是否发生改变。在测定蛋白质相互作用方面，SPR方法非常精确、敏感性高。2)用真核细胞表达载体携带正常NaspcDNA和基因突变的NaspcDNA进入小鼠T细胞内并进行高表达Nasp蛋白质，然后测定细胞内DNA量的变化和溴化尿嘧啶(BrdU)掺入水平，来检测细胞增殖反应的程度。通过比较细胞内高表达的正常Nasp蛋白质和突变的Nasp蛋白质对细胞增殖影响的差异有无或程度，来检验突变的Nasp蛋白质的功能是否发生了改变。2.根据权利要求1所述的突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制，其特征在于：将狼疮小鼠Nasp基因的突变外显子替代正常B6...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠吉雨，徐志伟，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37