本发明专利技术是海藻糖的发酵制备方法，该糖是由扣囊复膜酵母Ａ１１菌株，其菌种保藏号为：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４２６，保藏日期为２００５年７月２５日；而发酵产生的。其制备方法如下：（１）制备种子液；（２）发酵罐发酵；（３）蒸馏水提取；（４）超滤膜提取；（５）脱色；（６）真空浓缩；（７）将（６）步的浓缩液冷冻干燥，得海藻糖晶体。本发明专利技术由于用可溶性淀粉或用玉米淀粉代替葡萄糖发酵，节约了成本，使得海藻糖积累量达到了２２．８９％。本发明专利技术由于采用蒸馏水提取，提取率在：１２．９９％－１６．４９％。该海藻糖具有较高的热稳定性。其应用于农业、花卉栽培；用于提高双岐杆菌的存活率保证其货架寿命的保护剂；用于食品烘烤制品类；用于糖果类与其它大多数增甜剂混合；用于配制“益齿”产品；具有积极的工业实用性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物发酵技术的改进，具体讲是一种。其属于生物技术、轻工业生产
技术介绍
现有技术中的海藻糖(Trehalose)又名覃糖，存在于细菌、酵母菌、真菌以及一些昆虫、脊椎动物和植物中。海藻糖不仅可以作为细胞碳源储存物，而且可用作高效保护剂增加细胞组分对不良环境条件(如高温、冷冻、脱水、高渗透压和高酒精浓度)的抗性。海藻糖的这种保护特性使它在许多方面具有广泛的应用，如医学和微生物学中作为细胞防冻剂、作为化妆品的有效成分、作为诊断试剂和生物产品的稳定剂。应用海藻糖作为保护剂是目前其它种类的保护剂都不可能达到的效果，例如利用海藻糖作为诊断工具酶等生物试剂的稳定剂和保护剂，可置于常温条件下干燥并保存，不仅简化了生物试剂的制备过程，也给患者的疾病诊治带来便利。海藻糖还可以用作新鲜食品的防腐剂，还可应用于研究用生物试剂的保存，例如各种工具酶、细胞膜、细胞器、抗体、抗原及病毒等等，使得生命科学研究更为方便快捷有效。因此，致力于用廉价的方法生产海藻糖是生物技术、轻工业生产
的科技人员的研究课题。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的就是要提供一种发酵制备海藻糖(Trehalose)的方法。本专利技术由济南地区空气中分离得到扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11突变株的菌种保藏号为CGMCC No.1426，保藏日期为2005年7月25日。保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址中国科学院微生物研究所。本专利技术采用YPD培养基蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH5.5；将该YPD平板暴露于空气中，再在30℃下培养48小时，挑取单菌落，再在YPD平板上划线纯化，直到得到纯种扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)。取菌种在YPD液体培养基30℃培养48h，检测海藻糖含量，取海藻糖含量最高的为目的菌株。对目的菌株鉴定为扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)。经化学诱变；筛选；将挑选出的突变株接入YPS培养基，两次在30℃下振荡培养后。用蒽酮法检测各个突变株海藻糖积累量，并与野生型的海藻糖积累量作比较；挑选出海藻糖积累量较高的目的菌株。本专利技术的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种海藻糖(Trehalose)的发酵制备方法。所述的海藻糖(Trehalose)是由扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligerasdu)A11菌株CGMCC No.1426发酵产生的；所述的制备方法如下(1)制备种子液将菌种保藏号为CGMCC No.1426的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11菌株活化培养1-2天后，由斜面菌苔接种入装有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃振荡培养24-36小时，以培养好的菌悬液为种子液；(2)发酵罐发酵将该A11菌株的菌悬液以6-16％接种量接种入装有可溶性淀粉培养基的发酵罐中进行培养，发酵罐培养温度为25-35℃，通气量为1.0-4.0∶1，搅拌转速100-300rpm，培养pH5.3--5.7，隔4--6小时取样在100℃烘干至恒重检测菌体干重和测海藻糖含量，培养48--54小时后终止发酵，并将发酵液分离取菌体；(3)蒸馏水提取将分离的湿菌体按重量/体积比1∶4-12的投料比分次加入蒸馏水，并在75--85℃下水浴中提取，累计提取时间为28--32min，然后离心取滤液，弃去菌体；(4)超滤膜提取(3)步滤液中仍含有少量的可溶性多糖类和蛋白质，采用截流分子量为5Kda的超滤膜超滤，以除去分子量较大的多糖类和蛋白质物质；(5)脱色将(4)步超滤液用201X7型阴离子树脂柱和717型阳离子树脂柱，上柱脱色，收集洗脱液；(6)真空浓缩采用旋转蒸发仪真空浓缩(5)步的洗脱液，检测该浓缩液中的海藻糖含量在20--50％；(7)将(6)步的浓缩液在-50℃下直接冷冻干燥，得海藻糖晶体；该海藻糖是非还原性双糖，其分子式为C12H22O11，含两分子结晶水的相对分子量为378.33，溶解度10℃时为55.3，50℃时为140.1，90℃时为602.9；该糖的水溶液在37℃下可保存12个月，无色无嗅，口感略带甜味；该糖不能使斐林试剂还原，也不能被α-糖苷酶水解，在强酸条件下能被水解为两个葡萄糖分子；热稳定性在120℃的水中或在含蛋白质溶液的沸水中，90min褐变。所述的发酵罐装有的可溶性淀粉培养基的组成如下豆粕水解液1.0--6.0％(w/v)，可溶性淀粉0.5--6.0％(w/v)，其余为水。所述的可溶性淀粉，其是玉米淀粉，或薯类淀粉，或大米淀粉。所述的YPD培养基的组成如下酵母膏(粉)0.5--2.0％(w/v)，葡萄糖1.0--3.0％(w/v)，蛋白胨1.0--3.0％(w/v)，其余为水。本专利技术的优点在于由于分离得到的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera sdu)A11突变株，其菌种保藏号为CGMCC No.1426，保藏日期为2005年7月25日。由于该菌种经化学诱变技术，而获得酸性和中性海藻糖酶活力大大降低的A11突变株，而且该突变株在可溶性淀粉培养基中培养菌体内海藻糖的累积量较高。尤其重要的是用可溶性淀粉代替葡萄糖进行发酵，节约了成本。又用价格便宜的豆饼粉水解液代替蛋白胨和酵母粉，使得海藻糖积累量达到了21.2％(W/W)。用玉米淀粉代替可溶性淀粉来生产海藻糖能使海藻糖的生产成本更低，A11突变株在1％(w/v)玉米淀粉培养基中发酵48小时菌体内海藻糖的累积量达到22.89％(w/w)。本专利技术由于采用蒸馏水提取，将分离的湿菌体按重量/体积比1∶4-16的投料比分次加入蒸馏水，并在75--85℃下水浴中提取，累计提取时间为28--32min，然后离心取滤液，弃去菌体；其提取率在12.99％-16.49％。具体实施例方式本专利技术的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)由济南市空气中分离得到，采用YPD培养基(蛋白胨，2％；酵母粉，1％；葡萄糖，2％；琼脂，2％；pH，5.5)分离，将YPD平板暴露于空气中，在30℃培养48h，挑取单菌落在YPD平板上划线纯化，直到得到纯种酵母菌。取菌种在YPD液体培养基30℃培养48h，检测海藻糖含量，取海藻糖含量最高的为目的菌株。对目的菌株鉴定为扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)。化学诱变1)将扣囊复膜酵母由斜面转接入50ml YPD液体培养基，30℃振荡培养18小时，取适量培养液离心去上清液，菌体用无菌水离心洗涤三次后悬浮于诱变溶液(0.1M磷酸缓冲液，pH8.0，5％(v/v)EMS)中，30℃保温30min后迅速离心去上清，洗涤菌体后用5％(w/v)硫代硫酸钠处理15min，除去EMS的毒性。2)诱变后的酵母细胞转接入50ml YPD培养基，30℃下振荡培养18h，离心洗涤菌体后再转接入内含2.0％(w/v)海藻糖，20mg/1000ml赖氨酸的YNB培养基振荡培养12小时。加入1mg/ml的制霉菌素100μl继续本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种海藻糖（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）的发酵制备方法，其特征在于：所述的海藻糖（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）是由扣囊复膜酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｆｉｂｕｌｉｇｅｒａｓｄｕ）Ａ１１菌株ＣＧＭＣＣＮｏ．１４２６发酵产生的；所述的制备 方法如下：（１）制备种子液：将菌种保藏号为：ＣＧＭＣＣＮｏ．１４２６的扣囊复膜酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｆｉｂｕｌｉｇｅｒａｓｄｕ）Ａ１１菌株活化培养１－２天后，由斜面菌苔接种入装有５０ｍｌＹＰＤ培养基的 三角瓶中，３０℃振荡培养２４－３６小时，以培养好的菌悬液为种子液；（２）发酵罐发酵：将该Ａ１１菌株的菌悬液６－１６％接种量接种入装有可溶性淀粉培养基的发酵罐中进行培养，发酵罐培养温度为２５－３５℃，通气量为１．０－４．０∶１，搅拌转 速１００－３００ｒｐｍ，培养ｐＨ５．３－５．７，隔４－６小时取样在１００℃烘干至恒重检测菌体干重和测海藻糖含量，培养４８－５４小时后终止发酵，并将发酵液分离取菌体；（３）蒸馏水提取：将分离的湿菌体按重量／体积比１∶４－１２的投料比分 次加入蒸馏水，并在７５－８５℃下水浴中提取，累计提取时间为２８－３２ｍｉｎ，然后离心取滤液，弃去菌体；（４）超滤膜提取：（３）步滤液中仍含有少量的可溶性多糖类和蛋白质，采用截流量为５Ｋｄａ的超滤膜超滤，以除去分子量较大的多糖类和蛋白 质物质；（５）脱色：将（４）步超滤液用２０１Ｘ７型阴离子树脂柱和７１７型阳离子树脂柱，上柱脱色，收集洗脱液；（６）真空浓缩：采用旋转蒸发仪真空浓缩（５）步的洗脱液，检测该浓缩液中的海藻糖含量在２０－－５０％；（７）将 （６）步的浓缩液在－５０℃下直接冷冻干燥，得海藻糖晶体；该海藻糖是非还原性双糖，其分子式为Ｃ↓［１２］Ｈ↓［２２］Ｏ↓［１１］，含两分子结晶水的相对分子量为３７８．３３，溶解度：１０℃时为５５．３，５０℃时为１４０．１，９０℃时为６ ０２．９；该糖的水溶液在３７℃下可保存１２个月，无色无嗅，口感略带甜味；该糖不能使斐林试剂还原，也不能被α－糖苷酶水解，在强酸条件下能被水解为两个葡萄糖分子；热稳定性：在１２０℃的水中或在含蛋白质溶液的沸水中，９０ｍｉｎ褐变。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王祥红，池振明，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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