应用热对流进行核酸序列扩增的方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供一种核酸序列扩增方法和其装置，其设计简单，易于微型化和一体化为复合装置，能够使用非热稳定性ＤＮＡ聚合酶。本发明专利技术中，多个热源结合在一起向样品的特定区域提供或者移走热量，通过将较高温度区域定位在高度上低于较低温度区域，从而在样品内部维持一个特定空间温度分布。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及扩增核酸序列的方法和装置。尤其涉及应用热对流的方法和装置，其中通过进行温度受控的包括聚合酶链式反应(PCR)及其相关过程在内的扩增过程，可以从含有DNA或RNA的遗传样品中扩增靶核酸序列。
技术介绍
以研发和诊断为目的，核酸序列扩增技术在生物科学，基因工程以及医学科学中具有广泛的应用。尤其是使用PCR(以下称为“PCR扩增技术”)的核酸序列扩增技术已经得到最广泛的应用。PCR扩增技术的详情公开于美国专利4,683,202；4,683,195和4,800,159和4,965,188号。已经开发了多种包含自动PCR扩增方法的装置和方法，来用于快速有效地扩增多种遗传样品。这种技术的基本工作原理如下。在商品化的PCR扩增技术中，制备样品包含待扩增的模板DNA、一对和模板DNA每条单链的特定序列互补的寡核苷酸引物、热稳定的DNA聚合酶以及脱氧核苷三磷酸(dNTP)。通过重复进行依次改变样品温度的温度循环，模板DNA特定部分核酸序列得到扩增。一般温度循环由三个或两个温度步骤组成，在温度循环内的扩增过程按照以下方式进行。第一步是变性步骤，其中加热样品至一定高的温度，双链DNA被分开成单链DNA。第二步是退火步骤，其中冷却样品至一定低的温度，在第一步中形成的单链DNA和引物结合，形成部分双链DNA-引物复合体。最后一步是聚合步骤，其中维持样品在一个适当的温度，DNA-引物复合体中的引物在DNA聚合酶的作用下延伸，产生和模板DNA的每条链互补的新的单链DNA。经过由上述三个步骤组成的每个循环，由两条引物序列所选定的靶核酸序列得到复制。一般通过重复温度循环约20-40次，可以得到几百万或更高拷贝数的靶核酸序列。变性步骤温度一般是90-94℃。退火步骤温度根据所用引物的融解温度(Tm)适当调节，一般在35-65℃。因为最常用的Taq DNA聚合酶(一种从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中提取的热稳定DNA聚合酶)在72℃时具有最佳反应活性，一般设定聚合步骤温度为72℃并且使用三步骤温度循环。因为Taq DNA聚合酶在广泛的温度范围内均具有聚合酶活性，所以也可采用两步骤温度循环法，该法中聚合反应温度同退火温度设定为相同温度。在最广泛应用的方法中，将含有样品的反应容器做成与具有高热传导性的固态金属块接触，该固态金属块通过和加热冷却装置结合来改变其温度，从而获得所需的样品温度循环。采用这种方法的商品常使用具有极高热传导性的镀金银块和/或Peltier制冷法，来获得快速温度改变。近来，已经发展了使用流体，比如气体或液体，来代替固态金属块作为热源的方法，得到快速温度改变，使用这种方法的产品正在商品化。在这类方法中，被加热到合适温度的流体以一种使流体热源和包含样品的反应容器间能获得有效热接触的方式环绕反应容器循环。获得快速温度循环的其他类型的方法也已得到开发。其它实例包括用多个具有各自特定温度的热源依次接触含有样品的反应容器或样品本身的方法，和直接用红外辐射加热样品的方法等。现有核酸序列扩增装置具有许多缺陷，因为根据三步骤或两步骤温度循环该装置要完成改变整个样品的温度。首先，由于改变样品温度的过程是必须的，现有温度循环型核酸序列扩增装置在设计上是复杂的。为了完成这样的温度改变过程，包含固体金属块或流体作为热源的方法要求迅速均一地控制和改变热源温度的装置，和控制温度改变时间间隔的装置。同样地，反应容器或样品要依次接触多个具有各自特定温度的热源的方法，需要快速准确移动反应容器或样品的装置以及控制移动时间和间隔的装置。其次，由于现有核酸序列扩增装置设计复杂，将其整合为一个复合装置或微型设备是困难的。近来，在生物
正在开发微型复合装置。例如，“芯片上的实验室(Lab-on-a-chip)”已经研制出来，将样本传送通道、阀门、压力测量器、反应容器、检测部件等通过光刻光(photolithography)整合成一个在玻璃、硅或者多聚物平板上的单一单位。这种微型复合装置预期将在多种研究和医学目的中有广泛的应用。当核酸序列扩增装置需要整合成这种微型芯片时，由于现有方法为了实现温度改变过程所需的复杂设计，使其在微型化上具有缺陷。此外，将现有装置整合为复合的装置是困难的，因为在复合的装置中快速的温度变化是不可取的。第三，现有核酸序列扩增装置只能使用热稳定DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶。这是因为现有装置具有将整个样品加热到一定高温的过程。最后，现有核酸序列扩增装置在减少PCR反应时间方面具有局限性。因为现有装置需要改变整个样品温度的过程，PCR反应时间必须需要比温度改变所需时间多的时间或至少一样多的时间。
技术实现思路
本专利技术意图解决上述困难。本专利技术的一个目的是提供一种基于热对流的新型核酸序列扩增方法和其装置。根据本专利技术的新方法和装置是这样扩增核酸序列在样品内形成多个具有不同温度的特定区域，从而不同区域的温度梯度导致样品发生自然热对流。本专利技术的目的也是提供一种在设计上更简单的方法和其装置，不需要现有温度循环方法和装置中需要的复杂的成分，比如以一种可控方式改变温度的装置和控制温度改变的时间间隔的装置。因此，本专利技术的另外一个目的是提供一种比现有技术更简单的核酸序列扩增方法和其装置，使其可以容易被微型化并且整合为复合的微型化装置，如芯片上的实验室。本专利技术还有一个目的是提供一种基于热对流的核酸序列扩增方法和其装置，这种方法和装置不仅可以应用热稳定DNA聚合酶，而且可以应用非热稳定性DNA聚合酶。本专利技术另外的目的是提供一种比现有技术更加有效的核酸序列扩增方法和其装置，无需现有技术必需的温度改变过程。对于本领域技术人员来说，本专利技术其它目的和优势将在以下的详细描述、权利要求书附图中明确。为实现上述目的，本专利技术提供了一种新型核酸序列扩增方法和其装置，基于下面描述的新颖的热对流型运行原理。为实现上述目的，本专利技术提供了一种应用PCR的核酸序列扩增方法，该方法包括将样品注入反应容器的步骤，样品包含具有待扩增靶核酸序列的模板DNA、DNA聚合酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸，以及至少两条和核酸序列的每一个的3’末端互补的寡核苷酸引物；和在样品中维持特定的空间温度分布的步骤，多个热源与样品进行热接触，热源向样品特定区域提供热量或者移走热量，从而温度较高的区域在高度上低于温度较低的区域；其中特定空间温度分布包含这样的特定空间区域，每个特定空间区域各自执行一个温度条件，所述的温度条件适合于(i)变性步骤，其中双链DNA分离成单链DNA，(ii)退火步骤，其中变性步骤中形成的单链DNA与引物杂交形成DNA-引物复合物，或(iii)聚合步骤，其中通过聚合反应DNA-引物复合物中的引物得以延伸，并且其中特定空间温度分布是一种通过热对流导致样品循环的温度分布，由此变性、退火以及聚合步骤在样品内依次和重复发生。为实现上述目的，本专利技术提供了一种应用PCR的核酸序列扩增装置，该装置包括多个热源，可给包含在反应容器中的样品的多个特定区域提供热量或移走热量，其中热源设计为可以维持样品的特定空间温度分布，从而较高温度区域在高度上低于较低温度区域， 其中特定空间温度分布包含各自执行一种温度条件的特定温度区域，该温度条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）的核酸序列扩增方法，该方法包括：将样品注入反应容器的步骤，该样品包含具有待扩增的靶核酸序列的模板ＤＮＡ、ＤＮＡ聚合酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸，以及至少两条和每个 靶核酸序列３’末端互补的寡核苷酸引物；和通过多个热源与样品进行热接触在样品中维持特定的空间温度分布的步骤，该热源向样品特定区域提供热量或者从特定区域移走热量，使得温度较高的区域在高度上低于温度较低的区域，其中特定空间温度分布 包含这样的特定空间区域，每个特定空间区域各自执行一个温度条件，所述的温度条件适合于（ｉ）变性步骤，其中双链ＤＮＡ被分离成单链ＤＮＡ，（ｉｉ）退火步骤，其中变性步骤中形成的单链ＤＮＡ与引物杂交形成的ＤＮＡ－引物复合物，或（ｉｉｉ）聚合步骤，其中通过聚合反应使ＤＮＡ－引物复合物中的引物得以延伸，并且其中的特定空间温度分布是通过热对流引导样品循环的温度分布，由此变性、退火以及聚合步骤在样品内依次和重复发生。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄贤镇，金廷姬，郑敬勋，
申请(专利权)人：阿赫姆生物系统公司，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]