杀虫蛋白制造技术

本发明专利技术涉及杀虫活性蛋白质的新种类，及编码这些蛋白质的多核苷酸序列。在优选的实施方案中，这些杀虫蛋白的分子量为大约４０－５０ｋＤａ和大约１０－１５ｋＤａ。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关申请的相互参考本申请是1999年8月20日提交的美国流水号09/378,088的部分延续中请。
技术介绍
鞘翅目是一类重要的农业害虫，每年都引起严重的作物损失。鞘翅目昆虫的例子有玉米根虫和苜蓿象鼻虫(alfalfa weevil)。苜蓿象鼻虫—紫苜蓿叶象(Hypera postica)及其近亲埃及苜蓿叶象(Hypera brunneipennis)是在美国种植的苜蓿的最重要的昆虫害虫，1984年有290万英亩遭到感染。每年花费合计2千万美元用于控制这些害虫。埃及苜蓿叶象是美国西南部的主要种类，它在炎热的夏天在此夏蛰(即夏眠)。在所有其它方面，它与在美国其它地区占优势的苜蓿象鼻虫是一样的。幼虫阶段是象鼻虫生活史中最具破坏性的阶段。通过取食苜蓿的生长芽尖，幼虫引起叶片的骨骼化、矮化、降低植物生长、并最终降低产量。严重的感染可以毁灭整个苜蓿条。同样取食叶片的成虫引起额外的、但是较小的损伤。每年美国有大约1千万英亩的玉米感染玉米根虫物种复合体。玉米根虫物种包括北方玉米根虫—长角叶甲(Diabrotica barberi)、南方玉米根虫—黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata howardi)、和西方玉米根虫—玉米幼芽根叶甲(D.virgifera virgifera)。这些叶甲物种居于土壤中的幼虫取食玉米的根，引起倒伏。倒伏最终降低了玉米产量，并常常导致植株的死亡。成年甲虫通过取食玉米穗丝降低了授粉，并由此对玉米单株产量产生不利影响。另外，叶甲属的成虫和幼虫还攻击葫芦类农作物(黄瓜、甜瓜、南瓜等等)、和商业性生产的许多蔬菜和田间农作物，以及家园种植物。已通过诸如轮作和高水平氮的应用等刺激不定根系生长的耕作方法，部分致力于对玉米根虫的控制。然而，化学杀虫剂严重依赖于确保实现期望的控制水平，杀虫剂结合或掺入到土壤中。使用一些化学杀虫剂的相关问题是环境污染和处理的昆虫种群中的抗性发展。土壤微生物苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，B.t.)，是一种形成芽孢的革兰氏阳性细菌，其特征为含有伴孢晶体蛋白质内含物，在显微镜下表现为独特形状的晶体。B.t.的某些菌株产生对特定目的害虫有毒的蛋白质。已经分离得到某些B.t.毒素基因，并进行了测序，而且已经生产了基于重组DNA的B.t.产品并批准使用。另外，通过基因工程技术，正在发展将这些B.t.内毒素投递到农业环境中的新方法，包括用内毒素基因将植物经基因工程改造成具有昆虫抗性的应用，和将稳定的完整微生物细胞作为B.t.内毒素投递载体的应用(F.H.Gaertner和L.KimTIBTECH 6S4-S7)。由此，分离的B.t.内毒素基因日益具有商业价值。B.t.杀虫剂的商业性使用最初被限制于小范围的鳞翅目(毛虫)害虫。苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(B.thuringiensis subsp.kurstaki)的芽孢和晶体制备物，作为针对鳞翅目害虫的商业性杀虫剂，已经使用了许多年。例如，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克HD-1变种(B.thuringiensis var.kurstaki HD-1)可产生对许多鳞翅目昆虫的幼虫有毒的结晶状δ-内毒素。在最近几年中，然而，研究人员已经发现了对更广范围的害虫具有特异性的B.t.杀虫剂。例如其它B.t.物种即以色列亚种和粉菌变种(a.k.a.B.t.M-7，a.k.a.B.t.san diego)，已经分别商业性应用于控制双翅目和鞘翅目昆虫(F.H.Gaertner“杀虫蛋白的细胞投递系统活的和死的微生物”，《农作物保护剂的受控投递》，R.M.Wilkins编，Taylor and Francis，纽约和伦敦，第245-255页，1990)。还可以参阅T.L.Couch(1980)“苏云金芽孢杆菌以色列变种的蚊子致病性”，工业微生物学的发展(Developments inIndustrial Microbiology)，2261-76；C.C.Beegle(1978)“虫生细菌在农业生态系统中的应用”，工业微生物学的发展，2097-104；A.Krieg、A.M.Huger、G.A.Langenbruch、W.Wchnetter(1983)Z.ang.Ent.96500-508描述了据报导对两种鞘翅目甲虫(Colorado potato beetle，马铃薯叶甲和蓝毛臀萤叶甲)有活性的苏云金芽孢杆菌粉菌变种(Bacillus thuringiensis var.tenebrionis)。最近，已经鉴定了B.t.新亚种，而且已经分离得到了负责有活性的δ-内毒素蛋白质的基因(H.Hfte，H.R.Whiteley微生物学回顾(Microbiological Reviews)52(2)242-255)。Hfte和Whiteley将B.t.晶体蛋白质基因分成四个主要种类CryI(鳞翅目特异的)、CryII(鳞翅目和双翅目特异的)、CryIII(鞘翅目特异的)、和CryIV(双翅目特异的)。已经报道发现了对其它害虫有特异毒性的株系(J.S.Feitelson、J.Payne、和L.Kim生物技术(Bio/Technology)10271-275)。Hfte和Whiteley对晶体蛋白质的1989年命名和分类方案，是基于推导的氨基酸序列和毒素的宿主范围。该方案覆盖了14种不同类型的毒素基因，分成五个主要种类。随着更多的毒素基因被发现，发现有类似序列的基因却具有明显不同的杀虫特异性，因此该方案逐渐变得不适用。已有人提出一种改进的基于氨基酸同一性的命名方案(Crickmore等人无脊椎动物病理学会，第29届年会，第3次国际苏云金芽孢杆菌研讨会，University of Cordoba，西班牙，9月1-6日，摘要)。除了cytA和cytB(仍作为单独的一类)外，所有毒素基因都保留了助记符“cry”。第一级的罗马数字换成了阿拉伯数字，去掉了第三级中的括号。目前的界线表示大约95％(第三级)、75％(第二级)、和48％(第一级)的序列同一性。除了提到的例外情况，许多原始名字得到了保留，但有些被重新分类。还可以参阅N.Crickmore、D.R.Zeigler、J.Feitelson、E.Schnepf、J.Van Rie、D.Lereclus、.J.Baum、和D.H.Dean(1998)“苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质命名法修改”，微生物学及分子生物学回顾(Microbiology and Molecular Biology Reviews)第62卷807-813；和Crickmore、Zeigler、Feitelson、Schnepf、Van Rie、Lereclus、Baum、和Dean，“苏云金芽孢杆菌毒素命名法”(1999)http//www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html。该系统使用免费的软件程序CLUSTAL W和PHYLIP。PHYLIP程序包中的NEIGHBOR应用程序采用算术均值(UPGMA)算法。在已发表的文献中，描述了B.t.晶体蛋白质基因在大肠杆菌中的克隆和表达(H.E.Schnepf、H.R.Whiteley美本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码杀虫蛋白的分离多核苷酸，其中所述蛋白质包含选自下组的氨基酸序列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９，及其变体。...

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：KE纳瓦，HE施奈普，M克努斯，MR保拉德，GA卡迪尼奥，GE史瓦伯，TE米歇尔斯，S芬斯塔德李，P迪耶尔，J杜吉洛，L斯坦普，RA赫尔曼，
申请(专利权)人：KE纳瓦，HE施奈普，M克努斯，MR保拉德，GA卡迪尼奥，GE史瓦伯，TE米歇尔斯，S芬斯塔德李，P迪耶尔，J杜吉洛，L斯坦普，RA赫尔曼，
类型：发明
国别省市：US[美国]