玉米肌动蛋白解聚因子的启动子和内含子制造技术

来自玉米肌动蛋白解聚因子的启动子和内含子、及其遗传变体或缺失型，可用于控制植物中转基因的表达。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程技术，提供了用于控制植物中重组基因表达的DNA序列和构建体。更具体地，本专利技术提供了来源于玉米肌动蛋白解聚因子(ADF)的新的调控序列。
技术介绍
植物基因工程技术需要使用用于调节转基因表达的各种不同遗传元件，比如启动子和内含子。转录的起始由启动子调控。一个典型的方案一般要使用几种不同地启动子。例如，一个启动子用来启动目的基因，另一个启动子用来启动可选择性标记基因。真核基因经常被称为内含子的非编码序列所中断。真核基因转录的最初产物是含有与内含子相应的序列的前体mRNA。转录后加工过程中除去内含子产生mRNA，该mRNA翻译产生蛋白质。对内含子在基因表达调节中的作用的研究表明，玉米的醇脱氢酶基因(Adh-1)的第一个内含子在厌氧条件下能够增强表达。Callis J.，M.Fromm，和V.Walbot.(1987)，Gene Dev.11183-1200。在非厌氧条件下该内含子也能促进表达(较低程度的)。这种增强被认为是核内前体mRNA稳定化作用的结果。Mascarenhas等报道利用Adh-1内含子使CAT的表达提高了12倍和20倍。Mascarenhas等，″Intron-Mediated Enhancementof Heterologous Gene Expression in Maize，″Plant MolecularBiology，15913-920，1990。从玉米和其他单子叶植物中已经分离了另外几种能增强基因表达的内含子。Vain，P.等(1996)，Plant CellReports 15489-494，也参见WO98/5921。玉米ADF的cDNA序列是已知的(GenBank的登记号为X97726)，但是基因组ADF序列没有公开。特别地，迄今为止ADF启动子的序列没有被公开，也没有任何ADF内含子被鉴定。序列的简要描述SEQ ID NO1是AP2/BC294 PCR产物的DNA序列，包括ADF启动子和ADF内含子1的序列。SEQ ID NO2是pDAB305的DNA序列。专利技术概述本专利技术提供了与ADF启动子和ADF内含子1相应的或来源于ADF启动子和ADF内含子1的DNA分子。本专利技术的另一个方面是提供了DNA构建体，该构建体包含从5’到3’方向操作性地连接的a)玉米ADF启动子；b)非翻译前导序列；c)内含子；d)目的基因；和e)3’UTR。在优选的实施方式中，ADF启动子包含SEQ ID NO 1的bp 1-734，内含子选自Adhl内含子1和ADF内含子1(SEQ ID NO1的bp882-2161)。本专利技术的另一个方面是提供了DNA构建体，该构建体从5’到3’方向含有a)在植物中具有功能的启动子；b)非翻译前导序列；c)ADF内含子1；d)克隆位点；e)3’UTR。本专利技术的另一个方面是提供了一种质粒，该质粒含有玉米ADF启动子，优选SEQ ID NO1的bp1-878，或含有玉米ADF内含子1序列，优选SEQ ID NO1的bp882-2161。本专利技术的另一个方面是提供一种转化植物，该转化植物至少含有一个包含本专利技术DNA构建体的植物细胞。该植物可以是单子叶植物或双子叶植物，优选的植物是玉米、稻、棉花和烟草。本专利技术的另一个方面是提供包含本专利技术的DNA构建体的种子或谷粒。本专利技术的一个方面是本专利技术涵盖了所有提供功能性植物启动子的任何ADF启动子缺失型变体，这种启动子都属于“ADF启动子”。为了本申请的目的，用实施例5的方法分析时，如果一个序列能代替pDAB621的bp3056-3790或pDAB625的bp3962-4694而产生一种使GUS发生本底水平以上瞬时表达的构建体，那么该序列就认为是提供了“功能性”启动子。本领域的普通技术人员能够理解，在不破坏序列的启动子功能的前提下，对SEQ ID NO1中作为ADF启动子的733bp的序列可以作各种不同的缺失。缺失试验是现有技术。优选地，本专利技术的ADF启动子包含200个连续碱基对，该连续碱基对与SEQ ID NO1的bp1-734所定义序列的200个连续碱基对一致。更优选的是这样的ADF启动子，其包含500个连续碱基对，该连续碱基对与SEQ ID NO1的bp1-734所定义序列的500个连续碱基对一致。相似地，本专利技术涵盖了与启动子一起使用时具有增强表达功能的ADF内含子缺失型变体。术语“ADF内含子1”包含了这种缺失型变体。优选地，本专利技术的ADF内含子1包含600个连续碱基对，该连续碱基对与SEQ ID NO1的bp882-2161所定义序列的600个连续碱基对序列一致。更优选这样的ADF内含子，其包含SEQ ID NO1的bp882-2161所定义序列的1000个连续碱基对。本专利技术的详细描述ADF启动子优选地用在含有内含子的构建体中，该内含子被插入在目的基因5’端和启动子3’端的非翻译前导区中。适合的内含子包括ADF内含子1、Adhl内含子1、泛素内含子1和Bronze2内含子1。用于本专利技术构建体的非翻译前导序列可以来自任何合适的来源，并可以进行特定的修饰以增加mRNA的翻译。5’非翻译区可以来源于启动子的天然前导序列、待表达基因或编码区域的天然前导序列、病毒RNAs、合适的真核基因，也可以是合成的序列。用于本专利技术构建体的目的基因可以是希望在植物中表达的任何基因。特别有用的基因是那些能够提供除草剂、昆虫或病毒耐性的基因和能够改善植物的营养价值或加工特性的基因。合适的农艺学有用基因的例子包括能提供昆虫抗性的来源于苏云金芽苞杆菌的杀虫基因，和5’-烯醇式丙酮酰-3’-磷酸莽草酸合成酶(5’-enolpyruvyl-3’-phosphoshikimate synthase，EPSPS)基因及其提供草甘膦除草剂抗性的任何变体。本领域的普通技术人员能很容易地理解，能够赋予期望性状的任何农艺学重要基因都是可用的。本专利技术的构建体所用的3’UTR，或3’端非翻译区是能够使mRNA进行有效加工，能够保持信息的稳定和指导腺苷核糖核苷酸加到转录后mRNA序列3’末端的3’UTR。此3’UTR可以是启动子区天然的，结构基因天然的，或者来自其他来源。许多在植物宿主中能够表达的基因来源的各种终止区域都是可用的，所述基因例如，细菌基因、冠瘿碱基因、病毒和植物基因。合适的3’UTRs包括但不限于以下的举例pre53’UTR(WO98/56921)、胭脂碱合成酶(nos)基因的3’UTR、tmL3’、或acp3’。本专利技术一般适用于在单子叶植物和双子叶植物中表达结构基因。本专利技术特别适合于单子叶植物种类的任何成员，包括但不限于玉米、稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、裸麦、甘蔗、菠萝、洋芋、洋葱、香蕉、椰子、和海枣。本专利技术优选的应用是生产转基因玉米植物。本专利技术特别适用于禾本科(Graminaceae)植物，特别是玉米、小麦、稻、燕麦、大麦和高粱。双子叶植物种包括烟草、西红柿、向日葵、棉花、甜菜、马铃薯、莴苣、瓜类、大豆和canola(菜子油菜)。除了ADF启动子外，ADF内含子1可以和其它启动子一起使用以增强表达。和ADF内含子1一起使用的启动子可以是适合用于植物的任何启动子。所选择的启动子单独使用应能使目的蛋白充分表达，但尤其是当和ADF本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有ＡＤＦ启动子的分离的ＤＮＡ分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：B罗宾威尔森，KA史密斯，
申请(专利权)人：道农业科学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]