用挑选的供体细胞实施核移植制造技术

本发明专利技术提供了一种用从供体细胞群挑选和分离的Ｇ１细胞进行细胞核移植的方法。该方法比现有技术优越，它提供了供体细胞核所处细胞周期时间阶段的确定性，并且考虑到生产具有农业、制药、滋补和生物医学用途的克隆化转基因或非转基因胚胎细胞、重建胚胎和完整的动物。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种核移植的新方法，明确地说，但决不排斥使用于产生哺乳动物胚胎、胎儿和后代，包括遗传工程或转基因哺乳动物胚胎、胎儿和后代的克隆技术中。
技术介绍
胚胎重建时供体细胞核和受体细胞质所处细胞周期的时间阶段是决定核移植后成功发育的关键因素。两种“细胞”的特定组合是确保第一次胚性细胞周期后得到一套二倍体染色质和将细胞核重编和随后的发育机会增加到最大限度所必须的。当细胞分裂期间的供体细胞核与去核中期停顿卵母细胞(称作细胞质或受体细胞)融合时，立即发生核膜解体(NEBD)并且供体染色质遭受染色体超前凝聚(PCC)(Barnes等，1993)。这些效应是由一个称作促成熟因子(MPF，也称作促减数分裂或有丝分裂因子，参考，综述，Campell等，1996a)的细胞质活性诱导的。在卵母细胞成熟中，MPF的活性在中期最高，而在受精或人工激活后迅速下降。所以，两种类型的细胞质可以用于重建；使用未激活或激活的中期II(M II)细胞质相应是MPF含量依次较高或较低的细胞质。在有助于认识到哺乳动物核移植中，细胞周期协调性对保持染色体完整和由此引起的发育潜能的重要性的早期研究工作中使用了来自诸如兔子、绵羊和牛等物种植入前胚胎的未分化卵裂球(即未特化胚胎细胞)。这些研究揭示出供体细胞核所处细胞周期的阶段和暴露于细胞质MPF的时间长度对观察到的PCC程度具有显著的影响。暴露于MPF中的S期细胞核染色质存在典型的粉碎化外形，并且染色体研究表明了畸形的高发率。(Collas等，1992b)。相反，处于G1或G2期的细胞核的染色质凝聚形成依次具有单股或双股染色单体的伸长的染色体(Collas等，1992b)。在适当的将重建胚胎从中期停顿中解放出来并激活发育的刺激作用后，核膜围绕供体染色质重组，随后不论其以前所处细胞周期阶段，供体染色质进行DNA合成。所以，处于G1期的供体细胞核发动了与正常发育相容的DNA合成，而处于G2期或S期的细胞核则完全或部分地再复制已经复制的DNA，如此以致，到第一次胚性细胞周期结束时，两个子细胞的DNA含量不正确，导致异常的早期胚胎发育。相反，这些早期研究表明在细胞质激活后经过一个足够长的间隔，等MPF消失后，把卵裂球细胞核移植到细胞质中，NEBD就不发生(所以PCC也不发生)并且供体细胞核依据其在移植时所处细胞周期的阶段控制DNA复制。所以，G1期或S期的细胞核分别启动或继续复制，而G2期的细胞核则不能诱导或进入另外一次DNA合成。这种预先激活的细胞质被命名为“通用受体”(Compbell等，1994)，其具有在细胞周期的任何阶段协调供体细胞发育的能力。这一点对克隆植入前胚胎特别重要，在植入前胚胎中大多数未分化卵裂球细胞核在任何时刻处于S期(80-90％，Barnes等，1993；Campbell等，1994)，所以最适合移植到含MPF较低的细胞质中。核移植之后，正常发育取决于卵母细胞细胞质里(或者外因诱导的辅助因子)具有重塑染色质结构和适当重编供体细胞核基因表达形式的因子。成熟细胞质包含指导正常受精的卵裂期胚胎发育到基因组正常激活时间的RNA转录物和蛋白质，基因组正常激活时间是指胚胎细胞核开始合成自已的RNA并指导胚胎发育。所以，来自已经越过基因组正常激活时间点的胚胎或细胞类型的供体细胞核必须在重建后停止它们的RNA合成，并且保持失活状态直到新的重编母体胚胎基因组转换发生。移植后，供体细胞核被迫重编合子状态，随后以正常胚胎发育发生所需的正确水平，适当的时空方式激活适当的基因。实现这个细胞核重编的机制目前不是十分清楚。鉴于新近用培养保存的细胞进行核移植的兴趣，重编和细胞周期协调已经成为重要课题。培养的细胞比用胚胎分裂球克隆用于早期研究的细胞更加分化(即具有更加特化的细胞功能)。这些细胞可以从胚胎、胎儿或动物成体中分离。因为可以得到较大数量的细胞，所以使用分化细胞培养物的高效核移植技术在家畜中可能实现大规模增殖希望的遗传型并且将加速培养细胞基因操作后转基因动物的生产。用活跃生长、未同步化的绵羊胚细胞(细胞周期不清楚)培养物的早期(Campbell等，1995)但不是后期的传代细胞(Campbell等，1996b)与前激活细胞质融合的早期研究实际上产生了分娩期羔羊。用去除血清5天后、处于静止状态的细胞(即，经此处理的细胞被认为退出正常的细胞分裂周期，进入所谓的G0状态)与其前、其后或同时用相似综合效率激活的细胞质融合的后续研究产生了活羔羊(Campbell等，1996b)。这些作者(Campbell等，1996b；Schnieke等，1997；Wilmut等，1997；专利WO97/07669)提出了使用退出正常细胞分裂周期并且被同步于静止或G0状态的细胞有助于细胞核重编和从分化细胞产生克隆化动物的重要性。由上述作者提出的优选实现细胞静止同步化的方法(以缺乏增殖细胞细胞核抗原(PCNA)为基础，该种状况表明没有细胞处于S期)是合适时间的血清饥饿。然而，近来，关于血清饥饿细胞中实际处于G0状态的细胞比例受到了质疑。使用双参量流式细胞计同时测量细胞DNA和蛋白含量(为了在二倍体群体中区分G0和G1期细胞，静止期细胞含有更少的RNA和蛋白)，Boquest等(1999)研究了培养的猪胎儿成纤维细胞的细胞周期特征。他们证实虽然经过了5天的血清饥饿处理，但是实际上根据他们的定义低于50％的细胞处于G0状态。通过挑选细胞群中的“小”细胞，血清饥饿培养物中G0细胞份额增加到72％(Boquest等，1999)。作为使用静止期细胞的替代方法，Cibelli和同事们(1998；和专利说明书WO 99/01163)报道了使用非血清饥饿的自由生长的牛细胞培养物与随后使用离子霉素和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)激活的中期II(M II)细胞质融合。但是，这些公告并未阐明使用这些方法最终产生克隆化小牛胚胎的供体细胞在核移植时所处细胞周期。同样地，其他报道说克隆化小牛(Vignon等，1998，1999；Zakhartchenko等，1999)和小鼠(Wakayama和Yangimachi，1999)已经从非血清饥饿的自由生长细胞培养物中产生。但是，与前面一样，产生克隆化后代的供体细胞在进行核移植时所处细胞周期的阶段不能确定。所以，上面所提的研究没有一项准确地证实细胞周期的哪个阶段或哪些阶段导致重建胚胎中最终发育成活后代的比例如此低。上述讨论强调，迄今为止，关于培养的供体细胞在核移植时所处细胞周期的描述总地来说少的可怜，这就使本技术水平不稳定并且不易重复。所以，期望有一种准确知晓供体细胞核所处细胞周期阶段的核移植方法。本专利技术的一个目的就是向前推进以便实现这一期望或者至少给公众提供有用的选择机会。专利技术概述根据第一个方面，本专利技术提供了一种核移植的方法，该方法包括从增殖的或未增殖的供体细胞群中挑选分离G1期细胞和从如此分离的G1期细胞中将一个细胞核移植到一个去核的受体细胞中。供体细胞群可以处于细胞周期的一个或多个已知或未知的阶段。该方法提供了关于供体细胞核在胚胎重建时所处细胞周期的阶段的确定性，所以优于现有技术。本专利技术考虑使用细胞周期抑制剂将自由生长的细胞阻滞在细胞周期的特定阶段，以便产生非增殖同步化细胞群。优选地，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞核移植的方法，该方法包括从增殖的或不增殖的供体细胞群中挑选和分离Ｇ１细胞，并将从如此分离的Ｇ１细胞中获得的一个核移植到去核受体细胞中。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：戴维韦尔斯，
申请(专利权)人：农业研究有限公司，
类型：发明
国别省市：NZ[新西兰]