具有一个或多个D-氨基酸取代的酶变体制造技术

本发明专利技术涉及与它们相应的野生型酶相比具有降低的免疫原性的酶变体。更具体地说，本发明专利技术涉及具有野生型氨基酸序列的改性的氨基酸序列的变体，其中改性的氨基酸序列包含用Ｄ－氨基酸的一个或多个氨基酸位的取代。本发明专利技术进一步涉及编码这种酶变体的突变基因以及含有这种的变体的清洁和个人护理组合物。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及相对于其相应的野生型酶具有降低的免疫原性的酶变体，以及含有该变体的组合物、编码该变体的DNA序列和使用该变体的方法。
技术介绍
酶构成最大类的天然存在的蛋白质并负责多种反应的催化。例如，一类酶包含催化其它蛋白质水解的蛋白质酶。通过将天然存在的和蛋白质工程的蛋白酶掺入到清洁组合物、特别是与洗衣应用有关的那些组合物中，人们已经在利用水解蛋白质的这种能力。其它酶例如淀粉酶和脂酶也因多种目的(包括淀粉和脂质的水解)结合入各种清洁组合物中。在清洁领域，这些蛋白酶中最广泛使用的是丝氨酸蛋白酶。这些丝氨酸蛋白酶中的大多数是由细菌生物体生产的，而另一些是由其它生物体例如真菌生产的。参见，Siezen，Ro1and J.等，“Subti1ases的同源性模拟和蛋白质工程战略，枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族”，蛋白质工程，第4卷，No.7,719-737页(1991)。所有这些酶的相似的性质涉及野生型酶在其相对于人造清洁组合物环境的自然环境中的效力。一般地，在自然环境中的效力不能转变为人造环境中的效力，致使酶的用途受限。例如，蛋白酶特征，例如热稳定性，pH稳定性，氧化稳定性和底物特异性，对于在该酶的天然环境之外的应用未必是最佳的。为了提高该酶在非天然洗涤环境中的效力，曾应用过几种方法来改变酶的野生型氨基酸序列。这些方法包含酶的基因重设计来增强例如热稳定性和在完全不同的条件下改善氧化稳定性。但是由于这样的基因工程酶对于哺乳动物是外源的，它们是潜在的抗原。作为抗原，这些酶在哺乳动物中可以引起免疫性反应和/或变应反应(这里简单地统称为变应原性或变应性反应)。实际上，在人经常暴露于酶中的环境中已发现了对酶的敏感。这些环境包括生产设备，在该环境中职员通过如无控灰尘或气溶胶化的媒介暴露于酶中。酶吸入肺中可导致气溶胶化，这是可引起最危险的反应的酶暴露的途径。在消费者重复使用含可引起变应性反应的酶的产品的市场中也会产生酶致敏。此外，尽管在对在洗衣应用中使用的更高效蛋白酶的不懈探索中基因工程已经是重要的了，但是目前在个人护理组合物和轻垢洗涤剂中最小程度地应用基因工程酶。象例如化妆品，手用/体用水剂和膏霜，肥皂，凝胶，浴液和香波这样的产品中没有基因工程酶的主要原因是由于导致不期望的变应反应的人类致敏的上述问题。因此，提供一种提供具有最小变应反应激发的基因工程酶的清洁性能的个人护理组合物是非常有利的。减弱酶的变应活性的一个方法是通过该酶的一个或多个抗原决定部位的重设计。抗原决定部位是通过抗体结合或者通过主要的组织相容性复合体蛋白(MHC)将处理过的抗原呈递给T细胞而诱发免疫反应的抗原的那些氨基酸区。抗原决定部位的变化能够影响它们作为抗原的效力。参见Walsh，B.J.和M.E.H.Howden，“以抗原决定部位图谱的修饰为基础测定变应原的IgE结合序列的方法”，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)，121卷，275-280页(1989)。已发现用一个或多个右旋氨基酸(下文简称为“D-氨基酸”)取代野生型酶中的一个或多个氨基酸残基、特别是在抗原决定部位取代时，可提供具有惊人的降低的变应性和/或免疫反应、同时仍保持酶效力的酶变体。作为参考氨基酸可以左旋(“L-氨基酸”)和右旋(“D-氨基酸”)构象存在。L-氨基酸为天然存在于自然界和大多数生物系统中的。此外，天然存在的多肽由L-氨基酸构成，因而可称为L-多肽。D-氨基酸为其L-氨基酸对应物的“镜像”。尽管D-多肽(完全由D-氨基酸构成的多肽)不是天然存在的，可人工合成这些多肽以形成三维的蛋白质结构。本专利技术者已发现优选地在酶的抗原决定部位区引入至少一个D-氨基酸，可使酶相对于野生型酶更少引起变应症。不受理论的限制，通常认为生物系统不会把含有D-氨基酸的抗原决定部位区识别为真抗原决定部位区。因此，不会发生通常会发生的变应性反应。但是，令人兴奋地，可保持生物功能和酶效力。因此，此处可提供降低的引起的变应性反应并保持酶效力的酶。因而，本专利技术涉及具有野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列的酶变体，该变体具有在一个或多个氨基酸位由取代D-氨基酸产生的取代。因此，本专利技术酶适合在几种类型的组合物中使用，包含但不限于洗衣、洗碟、硬表面、皮肤护理、头发护理、美容护理，口腔和隐形眼镜组合物。专利技术概述本专利技术涉及相对于它们的相应的野生型酶来说具有降低的免疫原性的酶变体。更具体地说，本专利技术涉及具有野生型氨基酸序列的改性的氨基酸序列的酶变体，其中所述酶变体包含在一个或多个氨基酸位由取代D-氨基酸产生的取代。该酶变体的至少一个氨基酸是L-氨基酸。本专利技术进一步涉及编码这样的变体的突变基因和含有这样的变体的清洁和个人护理组合物。本专利技术的详细描述下面描述本专利技术的基本成分。也包含本专利技术实施方案中使用的各种任选的和优选的成分的非限制性描述。本专利技术能包含任何必需的或任选的成分和/或这里描述的限定，由任何必需的或任选的成分和/或这里描述的限定构成，或者基本上由任何必需的或任选的成分和/或这里描述的限定构成。除非另有说明，所有的百分比和比例以重量计算。除非另有说明，所有的百分比以总的组合物为基础计算。所有的成分或组成含量都与那个成分或组成的活性含量有关，并且不包含在商业可获得的来源中可能存在的杂质，例如残留溶剂或副产物。这里提到的所有的文献，包括所有的专利，专利申请和出版物，都全文引作参考。此处提及的为包括、但不限于蛋白质、更特别地酶的原料的商品名。此处专利技术者不想受限于某种商品名的原料。可将与由商品名注明的原料相当的原料(如来自不同名称或编目(参考)号下的不同来源的原料)代替并将其用在此处的组合物中。如这里使用的，将用缩写来描述氨基酸，包括L-氨基酸和D-氨基酸。表I提供了这里使用的缩写表表I 如此处所用的，可通过参考表征变体的取代氨基酸位为变体命名。此处通过提供野生型氨基酸残基、随后是位号、随后是待取代的取代氨基酸残基表示取代。在取代氨基酸残基可为在该特定位处的允许的任何D-氨基酸时，提供以符号“D-*”表示。构成变体的多取代以符号“+”分隔。举例说明，甘氨酸在70位处的D-缬氨酸取代可表示为Gly70D-Val或G70D-V。在70位和72位都有D-氨基酸取代的变体的例子可表示为Gly70D-Val+Val72D-Ala或G70D-V+V72D-A。76位处任何D-氨基酸的取代的变体的例子表示为N76D-*。定义如这里使用的，术语“突变”指在基因序列和这些基因序列产生的氨基酸序列中的改变。突变可以是使野生型蛋白质序列缺失、取代或添加氨基酸残基。如这里使用的，术语“野生型”指没有突变的生物体生产的酶。如这里使用的，术语“变体”指具有不同于相应的野生型酶的氨基酸序列的酶。本专利技术的酶变体本专利技术者已鉴别出相对于相应的野生型酶具有降低的变应性反应的某些酶变体。已发现用一个或多个右旋氨基酸(下文简称为“D-氨基酸”)取代野生型酶中的一个或多个氨基酸残基可提供在特别是人造清洁和个人清洁环境中惊人地具有降低的变应性反应同时又保持了酶效力的酶变体。因而，此处提供的为具有至少一个D-氨基酸的酶变体、包含该变体的组合物、该变体的DNA序列编码以及特别是在清洁和个人护理领域使用该变体的方法。作本文档来自技高网...

【技术保护点】
酶变体，特征为该变体具有包含由取代Ｄ－氨基酸在一个或多个氨基酸位产生的取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中酶变体的至少一个氨基酸为Ｌ－氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：DJ维斯戈比尔，
申请(专利权)人：宝洁公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]