烟色烟管菌菌丝体多糖及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了烟色烟管菌菌丝体多糖及其制备方法和应用，包括如下制备步骤：通过摇瓶发酵收集烟色烟管菌菌丝体，经热水提取、乙醇沉淀、冻干、酶–Sevag法去蛋白得到菌丝体去蛋白多糖DBFM，经DEAE–32纤维素阴离子交换柱分离纯化得到菌丝体均一多糖DBFM3。本发明专利技术所制备的DBFM及DBFM3具有抗氧化和免疫调节作用，在抗氧化剂和免疫佐剂的制备方面具有应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
烟色烟管菌菌丝体多糖及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及烟色烟管菌菌丝体多糖及其制备方法，以及作为抗氧化剂及免疫调节剂的应用。
技术介绍
多糖组分是食药用真菌中已知的主要活性成份，食药用真菌多糖在国际上被称为“生物反应调节剂”，作为一种生物非特异性免疫促进剂，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血糖和降血酯等生物活性。烟色烟管菌(Bjerkanderafumosa)属于非褶菌目、多孔菌科、烟管菌属的药用真菌。野生烟色烟管菌的子实体在东北民间被认为具有抗肿瘤(尤其是抗子宫癌)的功效，但到目前为止，没有对烟色烟管菌多糖成分及功能的相关研究。近年来随着自然条件的破坏，野生真菌资源越来越匮乏，限制了药用真菌包括烟色烟管菌的进一步开发和利用。因此采用液体深层发酵法得到烟色烟管菌(B.fumosa)菌丝体，并对其菌丝体去蛋白多糖进行了分离纯化，得到均一的菌丝体多糖，同时对其生物活性进行研究，可以使其更好地应用于保健品、免疫佐剂的开发。
技术实现思路
本专利技术首次在烟色烟管菌菌丝体中提取得到去蛋白多糖DBFM，并进一步提纯制备了均一多糖组分DBFM3，并对DBFM和DBFM3的抗氧化活性和免疫作用进行了研究。具体来说，通过摇瓶发酵收集烟色烟管菌菌丝体，经热水提取、乙醇沉淀、酶–Sevag法去蛋白得到去蛋白菌丝体去蛋白多糖DBFM，之后经过DEAECelluloseDE-32(DEAE-32)阴离子交换柱层析，采用0～1mol/LNaCl溶液洗脱，于0.6～0.9mol/LNaCl梯度下洗脱得到均一多糖DBFM3。结果表明去蛋白多糖DBFM以及均一多糖组分DBFM3具有清除DPPH自由基、羟基自由基的活性，对由H2O2引起的DNA损伤和人骨髓神经母细胞SH–SY5Y损伤具有保护作用；对于不加有丝分裂原刺激的脾淋巴细胞具有促进增值的作用，同时对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖与LPS刺激的淋巴细胞增殖均有一定协同作用。本专利技术的烟色烟管菌菌丝体多糖的制备方法，按照下述步骤进行：1)菌丝体制备：烟色烟管菌(Bjerkanderafumosa)接种量为10％，温度28℃，转速150r/min，培养8天，得到烟色烟管菌菌丝体。2)烟色烟管菌菌丝体经沸水提、95％乙醇醇沉，得到烟色烟管菌菌丝体粗多糖，再用酶–Sevag法去蛋白、无水乙醇醇沉得到菌丝体去蛋白多糖DBFM。3)烟色烟管菌菌丝体去蛋白多糖DBFM经DEAECelluloseDE-32阴离子交换柱分离后得到三个组分，其中多糖组分DBFM3经SepharoseCL–6B凝胶层析柱纯化后检测为均一多糖，经HPGLC检测测定DBFM3分子量为1.8×105Da。4)烟色烟管菌菌丝体均一多糖DBFM3含有甘露糖、半乳糖醛酸和半乳糖，摩尔比为1：18.16：0.702，。红外光谱分析表明DBFM3为α型吡喃糖，NMR核磁共振分析显示：DBFM3含有1→3、1→6糖苷键。烟色烟管菌菌丝体多糖DBFM和DBFM3具有抗氧化活性和免疫调节活性，：具有显著地清除DPPH自由基、羟基自由基的活性，对由H2O2引起的DNA损伤和人骨髓神经母细胞SH-SY5Y损伤具有保护；对于不加有丝分裂原刺激的脾淋巴细胞具有促进增值的作用，同时对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖与LPS刺激的淋巴细胞增殖均有一定协同作用，且均一多糖DBFM3的生物活性较未纯化的去蛋白多糖DBFM明显提高。附图说明图1是(a)去蛋白多糖DBFM经DEAECelluloseDE-32阴离子交换柱层析图谱和(b)SepharoseCL–6B凝胶层析柱的洗脱曲线检测DBFM3均一性的洗脱曲线；图2是均一多糖DBFM3的HPGLC色谱图；图3是单糖组成色谱图，(a)为标准样，(b)为均一多糖DBFM3；图4是均一多糖DBFM3的红外光谱图；图5是均一多糖DBFM3的核磁共振谱图：(a)为1H–NMR，(b)为13C–NMR，(c)为1H–1HCOSY；图6是多糖的清除(a)DPPH自由基、(b)羟基自由基的活性；DBFM3为均一多糖，DBFM为未纯化的去蛋白多糖，VC为阳性对照；图7是(a)pUC–19DNA紫外照射后的凝胶电泳图，泳道1：Marker，泳道2：H2O2+DNA+芦丁，泳道3：H2O2+DNA+DBFM3，泳道4：H2O2+DNA+PBS，泳道4：未处理的DNA；(b)DBFM和DBFM3对H2O2损伤的SH–SY5Y细胞活性的影响；图8是多糖DBFM和DBFM3对有无有丝分裂原条件下小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法可按常规技术进行操作。本领域技术人员可以借助实施例更好的理解本专利技术；但是，本专利技术的保护范围不局限于所提供的实施例。实施例1：烟色烟管菌菌丝体的发酵种子液培养：250mL摇瓶中装新鲜种子培养基100mL，烟色烟管菌(Bjerkanderafumosa)菌种接活化后平板母种3块，每块0.5cm2。置于28℃、150r/min的恒温摇床上震荡8天。上述的1L种子培养基：0.1g/LCaCl2,1g/LKH2PO4,1.5g/LMgSO4,2g/L酵母浸膏,3g/L蛋白胨,20g/L葡萄糖。摇瓶发酵培养：500mL摇瓶中装新鲜发酵培养基200mL，培养8天，培养条件同种子培养基，得烟色烟管菌菌丝体。上述的1L发酵培养基：0.5g/LMgSO4,0.05g/LFeSO4,1g/LKH2PO4,0.02g/LCuSO4,0.4g/LK2HPO4,0.01g/LZnSO4,0.01g/LCoCl2,0.08g/LMnSO4,3g/L蛋白胨,53g/L玉米粉。实施例2：烟色烟管菌菌丝体多糖的提取、分离和纯化烟色烟管菌菌丝体去蛋白多糖的提取：菌丝体用蒸馏水冲洗干净，100℃加热2h后，过滤浓缩，加入4倍95％乙醇，充分搅拌，4℃静置过夜，离心收集沉淀，用无水乙醇、乙醚依次洗涤3次，沉淀冷冻干燥，得菌丝体粗多糖BFM。用酶–Sevag法对粗多糖进行除蛋白，5％多糖溶液与链蛋白酶(酶：蛋白＝1：50)混和后，加入少量二甲苯防腐，1％NaCl做激活剂，37℃保温24h。再与Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)一起振荡，离心，反复数次至无沉淀产生，无水乙醇醇沉、冻干，得菌丝体去蛋白多糖DBFM。烟色烟管菌菌丝体去蛋白多糖的分离纯化：取适量多糖DBFM溶于蒸馏水中，上样于已经平衡好的DEAECelluloseDE-32阴离子交换柱，先用两倍柱体积蒸馏水洗脱，再用两倍体积的0～1mol/LNaCl溶液洗脱，流速1mL/min，自动收集器收集(4mL/管)，用苯酚–硫酸法检测各管多糖含量，合并相同馏分，醇沉，冷冻干燥，获得烟色烟管菌菌丝体多糖，图1a是DBFM经DEAE–32阴离子交换柱的洗脱曲线的三个洗脱峰，其中使用蒸馏水洗脱的为中性多糖，命名为DBFM1；0.2-0.5mol/LNaCl梯度下洗脱的为酸性多糖组分I，命名为DBFM2；0.6-0.9mol/LNaCl梯度下洗脱的为酸性多糖组分II,命名为DBFM3。将DBFM1、DBFM2和DBFM3复溶于蒸馏水，用SepharoseCL–6B凝胶层析柱检验糖的均一性，采用0.9％N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟色烟管菌菌丝体去蛋白多糖DBFM，其制备方法如下：将烟色烟管菌(Bjerkandera fumosa)菌丝体依次经热水提取、乙醇沉淀、酶‑Sevag法去蛋白，从而制备得到去蛋白多糖DBFM。

【技术特征摘要】
2017.02.08 CN 20171007213481.一种烟色烟管菌菌丝体去蛋白多糖DBFM，其制备方法如下：将烟色烟管菌(Bjerkanderafumosa)菌丝体依次经热水提取、乙醇沉淀、酶-Sevag法去蛋白，从而制备得到去蛋白多糖DBFM。2.一种烟色烟管菌菌丝体均一多糖DBFM3，其制备方法如下：将权利要求1所述的去蛋白多糖DBFM经DEAECelluloseDE-32阴离子交换柱层析，利用0～1mol/LNaCl溶液洗脱，在0.6～0.9mol/LNaCl梯度下洗脱得到均一多糖DBFM3。3.一种制备烟色烟管菌菌丝体去蛋白多糖DBFM的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)烟色烟管菌发酵得到菌丝体；(2)烟色烟管菌菌丝体热水提取；(3)将步骤(2)经热水提取后的菌丝体经乙醇沉淀得到菌丝体粗多糖BFM；(4)经步骤(3)的菌丝体粗多糖BFM经酶-Sevag法去蛋白后得到去蛋白多糖DBFM。4.权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：将去蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凡，刘迪，高莹，陈珊，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22