高产洛伐他汀枝状枝孢菌Cc‑106菌株及其用途制造技术

本发明专利技术属于微生物生物技术领域，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的枝状枝孢菌（

【技术实现步骤摘要】
高产洛伐他汀枝状枝孢菌Cc-106菌株及其用途
本专利技术属于微生物生物
，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）Cc-106菌株、用途和发酵生产方法。
技术介绍
Lovastatin是各国公认的降低胆固醇的理想药剂，具有高效、低毒、安全的特点，它能选择性抑制羟甲基戊二酸辅酶A（HMG-CoA）还原酶活性，并阻断胆固醇生物合成，近年来在临床治疗方面应用十分广泛。从1979年，日本学者远滕章（AkiraEndo）教授从红色红曲霉（Monascusruber）的培养液中分离出一种能够强力抑制胆固醇合成的活性物质，命名为MonacolinK（莫纳可林K）开始，时隔1年，美国Albert等从土曲霉（Aspergillusterrers）中发现了相似的物质，并命名为Mevinolin，现称Lovastatin。此后发现Lovastatin存在于包括侧耳属（Pleurotus）、茎点菌属（Phoma）、青霉属（Penicillium）、发光类脐菇（Omphalotusolearius）在内的多种真菌中。枝孢菌（Cladosporium）属于半知菌，是一类能够产生分生孢子的霉菌；孢子分布广泛，室内和室外空气中含量丰富；菌落褐绿色，经常与曲霉、青霉混淆；但是枝孢菌的菌丝是有颜色的，菌落整体呈现深色。有文章和专利报道，枝孢菌可用于：①纤维素酶、木质素酶、超氧化物歧化酶、脂肪酶等酶制剂的生产，②可产生紫杉醇等抗肿瘤、抗细菌真菌等活性代谢产物，③可用作微生物农用杀虫剂等。
技术实现思路
针对市场上Lovastatin需求日益增长，生产Lovastatin优良工业菌株的缺乏等的问题。本专利技术的目的是提供1株高产Lovastatin枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）Cc-106菌株和发酵生产Lovastatin的方法。本专利技术所述枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）Cc-106菌株，保藏编号为：CCTCCM2016380，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2016年7月7日。Cc-106菌株的形态特征：在PDA培养基上28℃培养7d形成较典型的菌落。菌落突点状，褐绿色，菌丝厚绒毛状，较致密，与培养基结合紧密，不易挑起，菌落背面墨绿色（附图1）。显微镜观察菌丝细胞丝状交织，有分隔，壁光滑或粗糙（附图2）。分生孢子梗直立，在中部形成分枝（附图3）；分生孢子簇生或单生，无隔或有隔，分生孢子椭圆形至梭形，单细胞大小差异较大，长×宽平均大小为5.5µm×3.5µm（附图4）。ITSrDNA基因序列分析结果表明，其长度为525bp（附图5），与枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）的进化距离最近（附图6）。根据Cc-106菌株的形态特征，结合枝孢菌属（Cladosporium）分种检索表，将Cc-106菌株鉴定为枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）。Cc-106菌株具有高产Lovastatin、产孢量多、培养简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.0~5.5，培养温度为28℃条件下，Cc-106菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，发酵80h~136h，Lovastatin产量可达184mg/L左右（附图7）；用液相色谱-质谱联用技术分离检测发酵液中的Lovastatin，结果表明分离物的结构、分子量与Lovastatin准品一致（附图8）。枝状枝孢菌Cc-106菌株丰富了生产Lovastatin的菌种。枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）Cc-106菌株可用于发酵生产Lovastatin。用接种针挑取少量菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3d；取3个菌饼（直径8mm）接种于一级种子培养液中，摇床培养3d，制得一级种子液；在二级种子培养液中，按10%加入一级种子液，200r/min摇床培养2d成二级种子液；在5L发酵罐发酵培养液中按20%接入二级种子液，发酵时间为80h~136h；发酵培养结束后，取发酵液1mL，加甲醇4mL（按1:4的比例），超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，可达184mg/L左右（附图7）。本专利技术利用丰富的霉菌自然资源，筛选到1株高产Lovastatin的枝状枝孢菌Cc-106菌株，该菌株具有高产Lovastatin、产孢量大、培养简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.5，培养温度为28℃条件下，Cc-106菌株5L发酵罐液体发酵80h~136h，Lovastatin产量可达184mg/L左右（附图7）。产生Lovastatin的枝状枝孢菌目前还未见有报道，本专利技术丰富了生产Lovastatin的菌种。附图说明图1Cc-106菌株PDA培养基上培养10d菌落正面和背面。图2Cc-106菌株菌丝和分生孢子梗的显微特征（200X）。图3Cc-106菌株分生孢子梗的显微特征（200X）。图4Cc-106菌株菌株分生孢子显微特征（400X）。图5Cc-106菌株ITSrDNA基因序列（525bp）。图6基于枝孢菌属（Cladosporium）ITSrDNA基因序列建立的Cc-106菌株系统发育树。图7Cc-106菌株在5L发酵罐中的生物量和Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。图8Cc-106菌株发酵液Lovastatin液相色谱-质谱联用检测图。保藏声明枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）Cc-106菌株，保藏编号为：CCTCCM2016380，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2016年7月7日。具体实施方式下面对本专利技术具体实施方式做一个详细的说明。培养基实施例1高产Lovastatin枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）Cc-106菌株的分离、筛选和鉴定①PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%，pH5.5~6.0。用于霉菌菌株的分离纯化和鉴定。②PD培养液：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%，pH5.5~6.0。用于高产Lovastatin霉菌菌株的筛选。实验方法2.1霉菌菌株的分离纯化从不同生境收集的样品（食品、土壤、水果、有机质等）表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板表面，28℃培养24h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3d产生孢子后，显微镜观察具有霉菌的典型特征，挑取少许边缘菌丝纯化3次，得性状均一的霉菌纯菌株。将分离纯化获得的霉菌菌株编号保存于25%甘油中，置于4℃冰箱备用。高产Lovastatin霉菌菌株的筛选用高效液相色谱法（HPLC）检测获得的178株霉菌纯菌株发酵液中Lovastatin产量进行筛选。霉菌各保存菌株28℃PDA平板培养3d后，用打孔器取3个菌饼（直径8mm）转接种于PD培养液中，28℃、200r/min摇床培养5d。取发酵液1m本文档来自技高网...

【技术保护点】
枝状枝孢菌（

【技术特征摘要】
1.枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）Cc-106菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCCM2016380，保藏日期为：2016年7月7日。2.权利要求1所述的枝状枝孢菌Cc-106菌株用于生产洛伐他汀。3.一种高产洛伐他汀的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：用接种针挑取少量权利要求1所述的枝状枝孢菌Cc-106菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3d；取3个菌饼接种于一级种子培养液中，摇床培养3d，制得一级种子液；在二级种子培养液中，按10%加入一级种子液，200r/min摇床培养2d成二...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋冬花，许楚旋，郑婕施，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33