The invention discloses a novel micro array microfluidic chip used for aptamer screening. The screening chip integrates microarray and microfluidic technology to assemble the positive and negative screening process on a microfluidic chip. After 7 rounds of screening, a high affinity aptamer is obtained. The invention also discloses the specific steps of the screening of the lactoferrin aptamer, including the detailed process of chip preparation, positive and negative screening process and PCR amplification. The method of screening aptamer specificity for the target protein, high affinity aptamers; and the antibody is more readily available and can be synthesized in vitro,; the preparation method is simple and quick, therefore the aptamer in many areas is expected to become a beneficial supplement of antibody technique. In addition, the chip pattern of the positive and negative sieve sets is convenient, fast and efficient, and can be used for the screening of other protein aptamers, and provides a good idea, design and reference for other aptamer screening workers.
【技术实现步骤摘要】
一种利用微阵列微流控芯片筛选适配体的方法
本专利技术属于生物检测
,具体涉及一种利用微阵列微流控芯片筛选适配体的方法。
技术介绍
适配体具有与抗体相类似的性质,但是在许多方面还体现出了优于抗体的特点:(1)特异性更强,对目标靶分子的亲和性比抗体更高;(2)适配体较抗体更容易获得(可人工合成,不依赖于动物和细胞),并且可以大量、快速的在体外合成,制备方法更为简单快捷;(3)可以针对不同种类的目标靶分子进行筛选,包括生物毒性分子以及只具有半抗原性的分子,拓宽了其应用范围;(4)无免疫原性,可在体内反复使用;(5)稳定性优于抗体,利于储存。随着适配体技术的不断进步,适配体在许多领域将有可能成为抗体技术有益的补充。正是基于适配体的各种优点,适配体在分析、临床、环境、分子识别及药物筛选等方面都显示出了广阔的应用前景。目前,基于纳米材料的适配体筛选技术可免除蛋白质在固相基片表面的固定,可有效减少筛选轮数,加速筛选流程。同时,基于微流控技术来提高筛选效果的方法获得了广泛的研究。这些方法包括:毛细管电泳的微流控适配体筛选,溶胶凝胶微流控适配体筛选,表面等离子共振(SPR)微流控适配体筛选,基于磁珠粒子的微流控筛选,以及基于各种材料微球的微流控筛选技术。科学工作者为了提高PCR扩增效率,采用琼脂糖液滴PCR扩增技术,聚乳液PCR扩增(ePCR)技术,此技术可以将阳性克隆子可以直接挑选出来进行测序,避免了传统适配体筛选过程克隆测序过程的繁琐。上述这些方法目的在于为了使适配体的筛选更加省时,自动化,高效并且可以降低整个筛选的成本。我们的工作在于发展一种更加稳定、筛选过程可 ...
【技术保护点】
一种利用微阵列微流控芯片筛选适配体的方法,其特征在于,所述的微阵列微流控芯片按照如下方法制备:将PDMS前聚体与固化剂按照质量比为5:1~100:1的比例混合,混合均匀后,将其放入真空干燥器中,连接循环水真空泵进行抽真空30min除气泡,再浇到微流控通道模板上,经固化后得到PDMS微流控通道,在玻璃基片上点制浓度为0.1~10mg/mL的乳铁蛋白和阴性蛋白微阵列,对PDMS微流控通道和点样后的玻璃基片同时等离子处理,将上述两种基片紧密贴合,得到微阵列微流控芯片。
【技术特征摘要】
1.一种利用微阵列微流控芯片筛选适配体的方法,其特征在于,所述的微阵列微流控芯片按照如下方法制备:将PDMS前聚体与固化剂按照质量比为5:1~100:1的比例混合,混合均匀后,将其放入真空干燥器中,连接循环水真空泵进行抽真空30min除气泡,再浇到微流控通道模板上,经固化后得到PDMS微流控通道,在玻璃基片上点制浓度为0.1~10mg/mL的乳铁蛋白和阴性蛋白微阵列,对PDMS微流控通道和点样后的玻璃基片同时等离子处理,将上述两种基片紧密贴合,得到微阵列微流控芯片。2.根据权利要求1所述的利用微阵列微流控芯片筛选适配体的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)筛选准备:将微阵列微流控芯片放入恒温水浴锅中,25~40℃下孵育蛋白1~12h;再通入5~20mg/mlBSA和0.01~0.5mM随机序列短链ssDNA(20nt)在25~40℃条件下封闭1~3h,之后用150μL1×PBST溶液清洗正负筛通道;(2)第一轮筛选:将0.1~10nmol,125μL原始文库在95℃加热3~15min,并立即在冰上冷冻10s~5min;用注射泵以1~5μL/min流速将文库通入正筛通道,在25~40℃条件下反应30~120min;之后以5~30μL/min流速通入150μL1×PBS缓冲溶液除去正筛通道中未结合的链;撕掉PDMS层,使用微阵列扫描仪扫描芯片;最后用DPEC水在95℃下加热3~10min洗脱芯片上乳铁蛋白结合的ssDNA,所得溶液在40~60℃条件下用高纯氮吹干至体积为25~250μL;(3)PCR扩增过程:将步骤(2)所得溶液分为体积均为23μL的3~10份相同溶液,每份依次加入25μL、2×Taq聚合酶,1μL、20μMTAMRA标记的前向引物和1μL、20μM生物素化的后向引物,混合均匀后进行PCR扩增;该步骤获得的产物作为模板稀释5~40倍后进行再一次扩增:取5μL稀释后的PCR产物与1μL2×SYBRPremixExTaqTM酶、1μL20μMTAMRA标记的前向引物、1μL20μM生物素化的后向引物以及18μL超纯水混合均匀,PCR扩增每进行一轮...
【专利技术属性】
技术研发人员:许丹科,李慧,陈竹,刘晓辉,
申请(专利权)人:南京大学,
类型:发明
国别省市:江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。