一种从种植红豆杉叶枝中制备紫杉醇的方法技术

本发明专利技术是一种从种植红豆杉叶枝中制备紫杉醇的方法。使用种植生长了２－４年的红豆杉的树叶、树枝，剪除直径小于０．５ｃｍ的树枝后粉碎，用７５％－９５％的乙醇浸泡２４－４８小时，过滤后去除废渣，滤液浓缩后用１∶１乙酸丁酯和水分散萃取，乙酸丁酯萃取液浓缩、干燥得到１％紫杉醇粗原料；利用１％紫杉醇粗原料，经常压正相硅胶柱层析，以乙酸乙酯和环己烷梯度淋洗，分段收集淋洗液，将紫杉醇含量在１０％－３０％之间的馏分浓缩后经反相Ｃ＃－［１８］高压液相色谱法分离。得到纯度为９９．５％以上的紫杉醇。该方法工艺简单、成本低、试剂溶剂无毒性、不破坏天然资源、有利于生态保护。该方法特别适用于使用种植的红豆杉为原料生产紫杉醇。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是。紫杉醇是红豆杉树种中发现的一种天然有机化合物，它对乳腺癌、肺癌和白血病细胞等具有强杀伤作用。1971年Wani和Wall等(J.Amer.Chem.Soc.，1971，93，2325)首次报道了紫杉醇的分离及理化特征，并确定了其优良的抗癌活性，引起了人们广泛的关注。1983年美国食品药品管理署(FDA)批准将紫杉醇列为治疗乳腺癌和子宫癌药物，进入I期临床试验。基于多期临床试验结果，于1992年底被美国FDA正式批准作为治疗晚期卵巢癌药物进入市场，1993年底又被批准用于治疗乳腺癌。由于紫杉醇副作用小，药效显著，被称为继阿霉素及顺铂后最热点的抗癌新药，需求量迅速增加。天然紫杉醇的来源极为有限，其主要来源于红豆杉树皮。红豆杉属植物，全世界有11种，中国有4种和1个亚种，分别为东北红豆杉(Taxus cuspid-ata Sieb.Et Zucc.)、南方红豆杉(Taxus mairei)、云南红豆杉(Taxus yunna-nensis)、西藏红豆杉(Taxus willichiana Zucc.)和美丽红豆杉(Taxus chinensis)。红豆杉树种生长极其缓慢，一颗生长百年的老树一般只能剥取25kg树皮，若提取1kg纯紫杉醇提供1万2千例癌病患者使用，相当于需要3万株红豆杉树的树皮。为了得到紫杉醇，国外开展了种植矮壮化的红豆杉树、组织培养、半合成和全合成紫杉醇等方法获取紫杉醇原料。美国使用杂交品种曼地亚红豆杉(Taxus media cv.Hicksii)，栽后3-5年其枝叶提取紫杉醇及其半合成前体物，向紫杉醇生产商百时施贵宝公司大量提供原料(Gragg等，J.Natural Prod.，1993，56，1657-1668)，但该树种生长缓慢。组织培养法获得的产量很小，培养液价格昂贵，全合成得率很小，成本巨大，难以商业化应用。半合成方法仍然需要天然红豆杉分离出的紫杉醇伴生物如10-去乙酰基巴卡丁III等作为初始原料。为了保护天然的红豆杉资源，维护生态环境，用生长快的、有效成分含量较高的种植红豆杉提取紫杉醇是最为有效的途径。最近，我国在山东、东北、江西、福建等地种植了一定量红豆杉林，以福建省三明地区种植的南方红豆杉数量最大，种植3年以上的南方红豆杉种植量约30万株，种植3年以上约130万株，2001年又种植了150万株。在该地区，南方红豆杉生长很快，每株2年生南方红豆杉枝叶干重可达1.2公斤以上，紫杉醇含量在0.016％-0.025％之间，具有很高的利用价值。对于红豆杉提取紫杉醇的分离纯化多为使用95％甲醇溶液浸取树皮提取液，提取液先进行脱脂后氯仿萃取；萃取液用水分散，氯仿层水层分离后浓缩，经色谱柱层析得到紫杉醇及其伴生物。常用的色谱柱层析法经需要多次柱层析，填料多分开填充不固定色谱柱，分离过程复杂，溶剂、淋洗液等毒性大，造成严重的污染。Senilh(J.Natural Prod.，1984，47，131)等从欧洲杉(Taxul bacata)提取紫杉醇先用乙醇萃取树皮，浓缩后，在水和二氯甲烷中分配，经“过滤”色谱法分离；硅胶柱色谱分离；然后经氧化铝色谱分离；再经中压硅胶柱色谱分离；最后采用制备高压液相色谱分离。Miller(J.Org.Chem.，1981，46，1469)用Taxus wallichiana树根、树干和树叶，经甲醇萃取、浓缩至固体，在水和己烷中分配，用氯仿萃取，然后浓缩，用硅胶柱分离；再二次硅胶柱色谱分离；经逆流分配，二次逆流分配；最后用HPLC分离纯化得到184个组分，制得的紫杉醇纯度约99.1％。整个提取纯化过程主要有八个步骤，其中包括两次正相色谱柱层析。Caster等(usp.5,440,055，1995)利用超临界法真接处理杉树叶子组织。因为杉树叶是可再生资源，利用树叶对保护稀有树种更加有益。该方法使用N2O、CO2、C3H8或CHClF2等作为超临界气体，处理经干燥粉碎的杉叶，经系统中淋洗液抽取及C18反向色谱柱分离，得到紫杉醇纯品，该方法处理约为每次30mg，最后得到的紫杉醇纯度约为99.4％。Polysciences Inc.从太平洋红豆杉树皮中分离紫杉醇。先甲醇或乙醇萃取树皮，混合萃取后浓缩除去大部分溶剂；浓缩液用二氯甲烷萃取，萃取质浓缩干燥至粉末；粉末用丙醇和里格罗因(1∶1)溶解，不溶组分过滤除去；不含有紫杉醇的滤液浓缩，溶于30％丙醇里格罗因溶液，经Florisil柱过滤；从柱中流出的紫杉醇组分结晶纯化二次；结晶的紫杉醇近一步在硅胶柱中分离，该步中最相似的产物三尖杉宁碱从紫杉醇中分离出来；从柱中流出的紫杉醇再结晶二次；未分离的混合物和其它溶质，循环处理得到紫杉醇。Rao等(usp.5,380,916，1992)使用臭氧处理最难分离的杂质组分三尖杉宁碱分离后得纯紫杉醇，淋洗液使用乙醇、氯仿等，最后反向制备色谱法分离粗产品后，仍含有一定量很难分开的三尖杉宁碱。紫杉醇与三尖杉宁碱的混合物通入臭氧氧化后，经过反向制备色谱分离得到纯度较高的紫杉醇，该方法需要使用二甲硫醚处理溶液中残留的臭氧及再结晶得到紫杉醇纯品。Kingston等(J.Natural Prod.，1992，55，259)也使用氧化剂OSO4氧化紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物。紫杉醇不与四氧化锇反应，三尖杉宁碱的C-13侧链末端双键被氧化，易与紫杉醇分开。Durand(usp.5,723,635，1998)利用离心分配色谱法分离纯化紫杉醇，使用一个C18反相色谱柱可以良好地从粗产物中分离纯化紫杉醇，一次处理量较大。主要有四个步骤在制备柱规模下，用反相色谱法处理紫杉醇粗处理物；从吸附剂上洗脱紫杉醇和其它产物；在洗脱的柱子中回收紫杉醇和相似物；使用臭氧纯化最终产物，从而分离除去紫杉醇的伴生物。使用红豆杉的新鲜枝叶，也可以直接作为原料提取紫杉醇。Nalr(usp.5,279,949，1994)使用正相硅胶柱色谱法从曼地亚(Taxus media cv.Hicksii)新鲜杉树组织分离紫杉醇及其同系物。新鲜杉树组织用乙醇和水的混合物萃取Taxanes，萃取质浓缩除去大部分有机溶剂，水溶性组分离心与含紫杉醇的固体沉淀分离，过滤后的滤液用活性炭脱色用硅藻土过滤，滤液挥发至干，真空下过硅胶色谱柱，液相分离得到产物。或者将硅藻土过滤的滤液真空下脱乙醇后，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，用真空液相色谱法经过硅胶柱纯化得到产物。Nalr(usp.5,478,736，1995)又通过改变萃取剂，即用甲醇和丙酮萃取新鲜杉树组织，可得到较高的紫杉醇产量。二次柱色谱分离，低压硅胶柱色谱分离粗紫杉醇组分，反相色谱最后纯化。直接利用反相制备色谱，分离纯化紫杉醇的方法较为繁杂。Rao(usp.5,380,916，1995)用95％乙醇萃取干树皮3-5次，乙醇萃取物浓缩，用1∶1氯仿分散萃取。氯仿分离，再用氯仿萃取水相2次，将氯仿蒸发浓缩至干，形成固体在C18填料层析柱上用乙腈和水梯度淋洗，分段承接含紫杉醇较高的馏分集中，用热水稀释后，反相柱再收集馏分，经重结晶得到高纯度的紫杉醇及其伴生物产品。上述许多方法中大多使用毒性较大的氯仿、二氯甲烷等溶剂，分离过程包括结晶法、氧化杂质法、多次正相色谱法、多次反相液相色谱法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从种植红豆杉叶枝中制备紫杉醇的方法。种植红豆杉叶枝特征是： （１）使用种植的南方红豆杉的树叶和直径在０．５ｃｍ以下的树枝，种植期生长２年以上； （２）本方法适用于种植的南方红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉、美丽红豆杉和曼地亚红豆杉等； （３）权力要求书１中（１）、（２）中的树叶、树枝，可以是新鲜的，也可以是干燥的； （４）对权力要求书１（３）中干燥的树叶、树枝的处理方法为阴凉处自然凉干或３０－６０℃加热干燥的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建民，詹华杏，陈建军，杨继东，陈友土，游为贵，
申请(专利权)人：明溪县天然药物研究所，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]