本发明专利技术公开了一种新的定向进化技术SNDS及所获得耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶。本发明专利技术以两个亲本酶基因的互补单链DNA为出发序列分别进行酶切消化，消化后产物不经回收直接混合进行无引物PCR、构建突变体库并筛选有益突变体。本发明专利技术方法实现序列相似性较低的两个亲本基因的突变，有效扩展了DNA改组方法的应用；简化小片段回收步骤；实现100％重组并显著降低传统DNA shuffling所存在的重组偏好性，产生更好的基因多样性及重组类型，能够在很少的重组子中筛选到有益突变。采用本发明专利技术方法对序列相似性仅为50.9％的甲基对硫磷水解酶的OPHC2和MPH基因进行突变重排，筛选获得高效耐热的甲基对硫磷水解杂合酶。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的蛋白质定向进化技术，尤其涉及一种定向进化技术SNDS，本专利技术还涉及应用该技术获得的耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶，属于蛋白质定向进化领域。
技术介绍
自从1994年Stemmer在Nature上首次提出DNAshuffling技术，并以β-内酰胺酶系统为试验对象，将其头孢噻肟的最低抑制浓度比原始菌株提高了32,000倍，DNAshuffling一直是蛋白进化技术中的研究热点。它不像计算机辅助下的理性设计(rationaldesign)如基于结构的重组(structure-guidedrecombinantion)那样局限(受限于选择的设计点)，也不像随机突变那样低效(产生大量无效突变)；它模拟了自然重组的某些方面，并能在一次实验中快速检测目的DNA上更多的区域，从而使得它在蛋白进化上的效果更为显著和高效。最初的DNAshuffling技术简单易得，使得它广泛的被使用，然而这项技术也有着很大的不足：(1)它产生的突变体库中嵌合率很低(<1％)(Stemmer,W.P.RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling.Nature370,389-391,doi:10.1038/370389a0(1994)；Kikuchi,M.,Ohnishi,K.&Harayama,S.Aneffectivefamilyshufflingmethodusingsingle-strandedDNA.Gene243,133-137(2000))，而绝大部分为没有发生重组的野生型，这可后面的筛选带来了极大的不便，从而导致效率很低；(2)这个方法对亲本(parentalgenes)的相似性要求很高(一般至少>80％)(Bacher,J.M.,Reiss,B.D.&Ellington,A.D.AnticipatoryevolutionandDNAshuffling.GenomeBiol3(2002)；Joern,J.M.,Meinhold,P.&Arnold,F.H.Analysisofshuffledgenelibraries.JMolBiol316,643-656,doi:10.1006/jmbi.2001.5349(2002)；Kikuchi,M.,Ohnishi,K.&Harayama,S.Novelfamilyshufflingmethodsfortheinvitroevolutionofenzymes.Gene236,159-167,doi:Doi10.1016/S0378-1119(99)00240-1(1999))，这样限制了它的使用范围；(3)对重组位点存在偏好性以及不能在一个目的序列中发生多次重组。针对这些不足，研究者做出了一些改进，其中主要分为两个方面：(1)在DNAshuffling的基础上进行改进，比如StEP，DNAfamilyshuffling等等。这些改进虽然解决了部分的问题，但是同时也产生了一些其他的限制。以DNAfamilyshuffling为例，虽然提高了嵌合率和对基因相似性的要求也有所降低，但是突变体库中仍然会出现大部分的野生型且只适用于同源性呈梯度分布的一系列基因；(2)抛弃了DNAshuffling传统的流程，只采用它的核心理念-DNA改组，比如ITCHY等等。虽然这些技术有效的解决了上述不足，但是同时也抛弃了DNAshuffling自身的优点，比如简单易得，高效等。这些改进或使得整个流程相当复杂，也降低了通用性，或者使得有益突变率极低，很难筛选到提升的突变子，而且大部分情况是两者都有。这些方法无法既保存了DNAshuffling的优点，同时又克服上述不足，所以导致虽然改进的方法层出不穷，但是最常用最有效的(相比而言)还是原始的DNAshuffling。在国内外大量生产并大面积用做杀虫剂的有机磷农药可以破坏乙酰胆碱酯酶的活性，从而引发一系列神经中毒症状，甚至死亡。因此，随着人们生活质量的提高和环保意识的加强，有机磷农药对于环境的污染和生态平衡的破坏越来越受到人们的关注，如何有效的去除有机磷农药残留、降低其毒性成为世界各国研究人员普遍关注并努力攻克的热点问题。有机磷降解酶(Organophosphorushydrolase，EC3.1.8.1)，它是一种可以水解磷酯键的酶，一方面，它可以断裂有机磷农药的磷酯键使其脱毒；另一方面，由于不同种类有机磷农药的区别大都是取代基不同，所以一种有机磷降解酶往往可水解多种有机磷农药。其中，甲基对硫磷水解酶(Methylparathionhydrolase，MPH)，它的最适底物是甲基对硫磷，酶分子结构解析和进化树分析结果表明，它属于β内酰胺酶家族(PFAMaccessionno.PF00753)。甲基对硫磷水解酶大都是在中国发现和分离得到的，主要分为两大类，一类是来源于Pseudomonassp.WBC-3、Plesiomonassp.M6、Ochrobactrumsp.M231等菌株的甲基对硫磷水解酶(MPH)，其氨基酸序列相似性很高，最低为98.2％。它们在酶学性质上表现出的共同特点是催化甲基对硫磷的效率高，碱性条件利于催化，热稳定性较差。另外一类，是从Pseudomonaspseudoalcaligenes分离出的OPHC2，与MPH的氨基酸序列最高相似性仅有50.9％，该类酶具有良好的热稳定性，但是催化甲基对硫磷的能力也相对较差。近年来本专利技术人实验室一直致力于有机磷降解酶方面的研究工作，从农药污染的土壤中分离得到一些高效降解有机磷农药的细菌，并且分离得到两个编码甲基对硫磷水解酶的基因：来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)的OPHC2(GenBank登录号：AccessionNo.CAE53631)和来源于苍白杆菌(Ochrobactrumsp.)的MPH-Och(GenBank登录号：AccessionNo.ACC63894)。其中MPH-Och与已报道的来源于Pseudomonassp.WBC-3的MPH相似性很高，达到98.2％，酶学性质也基本相同。比较MPH-Och与OPHC2发现，这两个酶蛋白氨基酸序列相似性为47.7％，酶蛋白的性质具有较大差异。OPHC2具有良好的耐热性，其降解甲基对硫磷的最适温度为65℃，在70℃保温30分钟后仍有近40％的活性。而MPH-Och酶反应的最适反应温度仅为20℃，在70℃保温不到2分钟，相对酶活性迅速降低至10％以下，保温5分钟后就基本丧失酶活力，其热稳定性要比OPHC2差很多。但是，MPH-Och在常温下对甲基对硫磷的催化效率明显优于OPHC2，它的比活性是23.23U/mg，约是OPHC2的5.8倍。因此，综合这两类酶的优点，开发出新型高效耐热的甲基对硫磷水解酶，对进一步降低该类酶的生产成本，推动其产业化具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种新的蛋白质定向进化方法，即：单链核苷酸DNA直接重组技术(SNDS，Single-strandedNucleotideDNAdirectlyShuffling)；本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白质的定向进化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以编码该蛋白质的两条互补单链亲本DNA序列为出发序列，将两条出发序列分别用DNase I进行酶切消化；(2)酶切消化后的产物不经回收直接混合进行无引物PCR；(3)以无引物PCR的产物为模板进行有引物PCR，回收PCR产物；(4)利用所回收的PCR产物构建突变体库；(5)从突变体库中筛选目标突变体，即得。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白质的定向进化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以编码该蛋白质的两条互补单链亲本DNA序列为出发序列，将两条出发序列分别用DNaseI进行酶切消化；(2)酶切消化后的产物不经回收直接混合进行无引物PCR；(3)以无引物PCR的产物为模板进行有引物PCR，回收PCR产物；(4)利用所回收的PCR产物构建突变体库；(5)从突变体库中筛选目标突变体，即得。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：两条单链亲本DNA序列的相似性≥50.9％；所述蛋白质优选为甲基对硫磷水解酶。3.一种定向进化获取耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以甲基对硫磷水解酶OPHC2基因和甲基对硫磷水解酶MPHM基因的互补单链DNA为出发序列，将两条出发序列分别用DNaseI进行酶切消化；(2)将酶切消化后的产物不经回收直接混合进行无引物PCR；(3)以无引物PCR的产物为模板进行有引物PCR，回收PCR产物；(4)利用步骤(3)所回收的PCR产物构建突变体库；(5)从突变体库中筛选目标突变体，即得。4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述用DNaseI进行酶切消化的体系包括：酶切消化的总体系为50μL，其中，10-15ng/μL单链DNA42.5μL，10×DnaseIbuffer5μL，40U/mLDnaseI2.5μL；所述酶切消化的条件包括：...
【专利技术属性】
技术研发人员：初晓宇，伍宁丰，王平，罗晓亮，田健，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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