本发明专利技术提供一种淋病奈瑟菌‑沙门菌双效疫苗，其中，沙门菌菌影作为递送载体负载淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗；以及其制备方法和应用。主要包括以下步骤：1)以淋病奈瑟菌基因组为模板，通过PCR扩增出孔蛋白B(PorB)基因并构建PorB DNA疫苗；2)构建温控表达载体pB‑E，并将其转化到沙门菌感受态中获得重组菌SE(pB‑E)，经温度诱导制得沙门菌菌影疫苗冻干粉；3)将淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗与沙门菌菌影冻干粉孵育，得到沙门菌菌影负载的淋病奈瑟菌PorB的菌影疫苗SE ghost(PorB)。该双效疫苗安全性良好、能同时诱导机体产生和提高针对淋病奈瑟菌和沙门菌的特异性体液免疫应答、黏膜免疫应答，并具有较高的抗体水平；在淋病和/或沙门菌防治方面具有重大意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学微生物学领域，具体涉及以淋病奈瑟菌PorB基因疫苗-沙门菌菌影疫苗为基础的双效免疫增强疫苗的制备及应用。
技术介绍
淋病是一种由淋病奈瑟菌引起的泌尿生殖系统黏膜的急性或慢性化脓性炎症，居我国性传播疾病首位。目前，全球每年约新增加10600万的淋病患者，危害十分严重。随着淋病奈瑟菌耐药菌株不断出现，抗生素治疗越来越困难，但由于对淋病奈瑟菌诱导免疫应答机制缺乏认识，目前仍没有有效的淋病疫苗面世。淋病疫苗的研制仍是淋病防治的重要策略。淋病奈瑟菌孔蛋白B(PorB)是抗原高度保守的外膜蛋白，具有较强的免疫原性，是淋病疫苗理想的候选抗原。淋病奈瑟菌PorB通过受体TLR2和髓样分化因子88(MyD88)诱导抗原提呈细胞B细胞的增殖及树突细胞的成熟活化，细胞表面高水平表达MHCⅡ和CD86，使孔蛋白PorB成为理想的佐剂。利用淋病奈瑟菌PorB核酸疫苗采用肌肉注射方式接种BALB/c小鼠后，在小鼠血清中能检测到PorB特异性抗体的产生，但抗体水平不高(ZhuW,ThomasCE,SparlingPF.DNAImmunizationofmicewithaplasmidencodingNeisseriagonorrheaPorBproteinbyintramuscularinjectionandepidermalparticlebombardment.[J]vaccine,2004,22:660-669)。目前，旨在提高淋病奈瑟菌PorB基因疫苗免疫效果的方法较少，主要以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位作为佐剂，诱导体液免疫应答和黏膜免疫应答，但免疫应答强度增加不明显(戴志兵等.抗淋病LTB-PorB核酸疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫应答的研究.分子与细胞免疫学.中国免疫学杂志.2010(26):1059-1068)。沙门菌属于革兰阴性细菌，能感染人和多种动物，常引起胃肠炎和菌血症，是重要的人畜共患病原体。沙门菌能穿过小肠黏膜层侵入上皮细胞，靶向肠道黏膜的M细胞，通过M细胞的摄取和转运到达黏膜下淋巴组织，诱导机体产生黏膜和系统性免疫应答。在控制沙门菌感染上，尽管传统的灭活疫苗和亚单位疫苗一直在使用，但是免疫效果不理想，也存在一些副作用；减毒苗的使用类似自然感染过程，在机体内可复制增殖，却存在毒力回复和潜在的污染的可能(B.R.Singh.Salmonellavaccinesforanimalsandbirdsandtheirfutureperspective.TheOpenVaccineJournal,2009,2:100-112)。目前，研究和开发新的疫苗仍是预防和控制沙门菌感染的重要措施。细菌菌影是革兰阴性菌通过噬菌体裂解基因的诱导形成不含核酸等胞质内容物的细菌空壳，它保留了天然细菌完整的外膜结构，不仅可作为疫苗诱导相关免疫应答，也可作为DNA、抗原和药物等的递送载体。尽管沙门菌菌影免疫已经在鸡等动物模型中取得了一定的免疫保护效果，但免疫保护效力仍需进一步提高(NandreRMetal.EnhancedprotectiveimmuneresponsesagainstSalmonellaEnteritidisinfectionbySalmonellasecretinganEscherichiacoliheat-labileenterotoxinBsubunitproteinComparativeImmunology,MicrobiologyandInfectiousDiseases,2013,36:537-548)。因此，如何提高沙门菌菌影疫苗的免疫应答水平和免疫保护效果仍需进一步研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种淋病奈瑟菌-沙门菌双效疫苗及其制备方法。该淋病奈瑟菌-沙门菌双效疫苗具有良好的安全性、能同时诱导机体产生和提高针对淋病奈瑟菌和沙门菌的特异性体液免疫应答、黏膜免疫应答，且具有较高的抗体水平。本专利技术的基本设计理念为：通过借助沙门菌菌影递送载体负载淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗；负载菌影疫苗性质稳定，不仅能同时诱导产生针对淋病奈瑟菌和沙门菌的免疫应答，而且显示了互为佐剂的双效免疫增强作用，为今后淋病奈瑟菌和沙门菌的感染机制、疫苗效果的研究奠定了基础；同时，该负载疫苗的研制进一步拓宽了新型疫苗的研究领域，因而具有广阔的市场前景。本专利技术的目的还在于提供上述淋病奈瑟菌-沙门菌双效疫苗、及其制备方法的应用。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种淋病奈瑟菌-沙门菌双效疫苗，其特征在于，包括淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗和沙门菌菌影，其中，沙门菌菌影作为递送载体负载淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗。本专利技术提供了上述淋病奈瑟菌-沙门菌双效疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以淋病奈瑟菌基因组为模板，使用上游引物(P1)和下游引物(P2)，克隆孔蛋白B基因并构建PorBDNA疫苗：PCR扩增淋病奈瑟菌PorB基因，并将其重组到真核表达载体pVAX1中获得PorBDNA疫苗pVAX1-PorB；大量提取质粒，PBS稀释后冻存备用；其中，PCR扩增引物的核苷酸序列分别如下：上游引物(P1)：CGGGGATCCATGAAAAAATCCCTGATTGCCCTG下游引物(P2)：CCCCTGCAGTTAGAATTTGTGGCGCAGAACGAC；(2)构建温控表达载体pB-E，并将其转化到沙门菌感受态中获得重组菌SE(pB-E)，经温度诱导制得沙门菌菌影疫苗，经真空冷冻干燥制备成菌影冻干粉：可选地，其具体步骤为：构建出含有噬菌体PhiX174裂解基因E的温控表达载体pB-E，并将其电击转化到沙门菌感受态中获得重组菌SE(pB-E)；重组菌SE(pB-E)经28℃振荡培养后转接于新鲜含Kan抗性LB液体培养基继续培养，待细菌OD600数值约0.3～0.4时，迅速升温至42℃诱导以制备沙门菌菌影SE-ghost，裂解完成后，4500rpm，15min离心菌液收集菌影，用冷冻干燥仪进行冻干，获得SE-ghost冻干粉备用；(3)负载淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗的沙门菌菌影双效疫苗的制备：将淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗与冻干的沙门菌菌影孵育，加入氯化钙溶液后得到负载的菌影疫苗SEghost(PorB)。本专利技术还提供了上述淋病奈瑟菌-沙门菌菌影双效疫苗、制备方法及其在免疫效力评价方面的应用。本专利技术的技术方案达到了如下的有益效果：(1)本专利技术提供了一种淋病奈瑟菌-沙门菌双效疫苗，该疫苗中，巧妙地将沙门菌菌影作为载体装载淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗，使得该淋病奈瑟菌-沙门菌双效疫苗具有良好的安全性、能同时诱导机体产生和提高针对淋病奈瑟菌和沙门菌的特异性体液免疫应答、黏膜免疫应答，且具有较高的抗体水平；有效地解决了目前尚无有效的淋病疫苗面世的技术问题。(2)本专利技术提供了沙门菌菌影SE-ghost的制备方法，裂解效率约99％。沙门菌菌影可作为载体装载核酸有较高的装载效率。将淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗与沙门菌菌影冻干粉孵育后得到负载淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗的沙门菌菌影SEghost(PorB)。(3)使用该方法制备的淋病奈瑟菌-沙门菌双效疫苗中，SEghost(PorB)可同时诱导出针对淋病本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种淋病奈瑟菌‑沙门菌菌影双效疫苗，其特征在于，包括淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗和沙门菌菌影疫苗，其中，沙门菌菌影作为递送载体负载淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗。
【技术特征摘要】
1.一种淋病奈瑟菌-沙门菌菌影双效疫苗，其特征在于，包括淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗和沙门菌菌影疫苗，其中，沙门菌菌影作为递送载体负载淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗。2.一种制备如权利要求1所述的淋病奈瑟菌-沙门菌双效疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以淋病奈瑟菌基因组为模板，使用上游引物和下游引物，通过PCR扩增出孔蛋白B(PorB)基因并构建PorBDNA疫苗：其中，所述的上游和下游引物的核苷酸序列分别如下：上游引物：CGGGGATCCATGAAAAAATCCCTGATTGCCCTG；下游引物：CCCCTGCAGTTAGAATTTGTGGCGCAGAACGAC；(2)构建可在沙门菌中表达的裂解质粒pB-E，其中所述的裂解质粒pB-E含有噬菌体PhiX174的完整裂解基因E；将质粒pB-E转化到沙门菌感受态中获得重组菌SE(pB-E)，经温度诱导制得沙门菌菌影疫苗，经真空冷冻干燥制备成菌影冻干粉；(3)负载淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗的沙门菌菌影双效疫苗的制备：将淋病奈瑟菌PorBDNA疫苗与沙门菌菌影冻干粉孵育，加入氯化钙溶液后制得负载的菌影疫苗SEghost(PorB)。3.如权利要求2所述的一种制备如...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦红梅，杨慧，贺丽，赵丹，李国才，陈瑾，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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